铝胁迫对油菜生长及叶绿素荧光参数、代谢酶的影响＊

王志颖, 刘 鹏, 李锦山, 吴惠芳, 郑 赟, 汪艳婷, 徐 艳

(浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江金华 321004)

铝是地壳中含量最丰富的金属元素,占其质量的 7%左右.在自然条件下,铝主要以铝硅酸盐形式存在,生物可利用性很小.但近年来,随着环境酸化问题的日益严重,尤其是大气污染引起的酸沉降和生理酸性肥料的大量施用,土壤酸化加剧,造成土壤中可溶性铝的含量明显增加[1-2].铝的存在形态与土壤 pH密切相关:当 5.0

油菜 (B rassica napusL.)是属于十字花科芸苔属 (B rassica)的油料作物,栽培面积在世界四大油料作物中居第 2位.我国是油菜生产大国,产量占世界第 1位[5].有研究指出:油菜种植在中性和微碱性土壤上含油量较高;在酸性土壤上次之;在碱性土壤上含油量最低[6].油菜适宜生长的土壤pH为 6～7,对土壤酸度反应很敏感[7].目前,我国油菜种植面积已突破 720万 hm2,大部分分布在南方酸性土壤区[5].因此,酸性土壤的铝毒害已成为我国油菜产量的重要限制因子.

通常认为,植物对铝毒害的反应首先表现在根系上[4],根系率先在形态上和生理特征上对铝毒胁迫产生反应[8],因此,通过研究铝毒对植物根系的影响,可进一步探讨植物对铝毒的胁迫生理和耐性.有关外界胁迫对植物叶绿素荧光参数影响的研究大多集中在小麦、水稻、大豆等,对油菜的相关研究方面,有报道指出:低磷处理明显降低了油菜蕾薹期、花期的净光合速率 (Pn),使油菜的光系统 Ⅱ(PSⅡ)量子产量 (ФPSⅡ)、电子传递速率 (ETR)和光化学猝灭系数 (qP)显著下降,非光化学猝灭系数 (NPQ)显著上升,表明低磷胁迫导致油菜蕾薹期 PSⅡ电子传递受阻[9-10];而对于铝胁迫下油菜叶绿素荧光参数的研究较少.研究发现,在铝胁迫下,一些植物种类或植物的某些品种或基因型能够通过根尖分泌有机酸(大豆根系主要是分泌柠檬酸)与铝螯合,从而缓解或解除铝对植物的毒害,这一作用属外部排斥机制,是迄今发现的植物最重要的耐铝机制之一[11-12].有研究表明,在铝胁迫下,黑麦的根尖柠檬酸合成酶(CS)的含量增加了 30%,表明铝诱导了 CS的合成.此外,在一种耐铝的大豆中,根尖的柠檬酸含量不受铝胁迫的影响,而 CS含量却增加了16%[13].然而,在铝胁迫下,有关油菜根尖代谢酶活性的变化情况也较少报道.

本实验研究了油菜生长过程中铝毒对其根和叶的相对长度、根系和叶的面积、叶绿素荧光参数及根系有机酸代谢酶活性的影响,为进一步研究油菜对铝毒的抗性机制提供一定的依据.

1 材料与方法

1.1 材料及其处理

经筛选,选用的供试材料为油菜 (B rassica cam pestrisL.)华油 2790(简称华油,铝敏感型)和中双 7号 (简称中双,耐铝型),由中国农业科学院油料作物研究所提供.种子放在清水中洗净,除去悬浮的不饱满种子,用去离子水浸泡 8 h,充分吸胀后,将种子均匀放置于垫了吸水纸的培养皿中,于 25℃黑暗中培养至露白.然后,把幼苗转移到沙土中,继续光照培养 1周,等植物长出 2片真叶时浇 1/2营养液适应几天,等幼苗粗壮时再进行水培.植株用蒸馏水洗去根系上的沙子,用海绵包住茎部,转移到黑色塑料盆中,每盆 50个孔,每孔 3株苗,加入完全营养液适应 7 d后进行铝处理,铝处理浓度分别为 0,50,100和 200μmol/L,每天上、下午通气2 h,每 3天换 1次营养液,处理7 d后进行各指标的测定.

1.2 相对根长和相对株高的测定

根长和株高采用刻度尺测量,每组处理重复10次,并计算相对值.

1.3 根系和叶面积的分析

采用扫描仪 (型号:canoscan4400F)对不同处理下油菜的第 1片真叶和根系进行扫描,用图像分析软件W inFOLJA分析叶的面积、宽度和长度;用W inRH IZO分析根系总长度、总表面积、总投影面积和直径.

1.4 叶绿素荧光参数的测定

采用叶绿素荧光仪 (型号:PAM210)对不同处理油菜的初始荧光 (F0)、最大荧光 (Fm)、原初光能转换效率 (Fv/Fm)、PSⅡ潜在活性 (Fv/F0)、光化学量子产量 (Yield)、非光化学猝灭系数(NPQ)等荧光参数进行测定.

1.5 根系酸代谢酶活性的测定

图 1 铝胁迫对油菜相对根长和株高的影响

参照文献 [13],称取植物根尖 0.1 g,置于4℃冰浴的研钵中,以 1 mL提取液研磨成匀浆.提取液包括:0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液 (pH 8.0),0.1%聚乙二醇辛基苯基醚 (Triton X-100),20 g/L聚乙烯吡咯烷酮 (PVP),10 mmol/L异抗坏血酸.用冷冻离心机在 4℃下15 000 r/min离心 5 min,上清液用于酶活性测定.柠檬酸合成酶(CS)的测定用二硫代双硝基苯甲酸 (DTNB)显色;苹果酸脱氢酶 (MDH)的测定用还原型辅酶Ⅰ(NADH)显色;磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PEPC)的测定用 NADH,MDH和磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)为试剂;乌头酸酶 (ACO)的测定用柠檬酸试剂.

1.6 数据统计分析

实验数据用 Origin 8.0和 Excel处理,SPSS统计软件进行邓肯氏法多重比较(P<0.05).

2 结果与分析

2.1 铝胁迫对油菜相对根长和株高的影响

从图 1可以看出:铝处理 7 d后,随着铝浓度的增大,油菜相对根长逐渐减小,且在 200 μmol/L铝处理下,华油和中双的相对根长分别为对照组的 64.5%和 67.2%,差异显著;而相对株高随着铝浓度的增加变化不大.表明油菜的根系比地上部对铝胁迫更敏感,且铝处理浓度越高,对油菜根系的伤害越严重.耐铝品种比铝敏感品种较少受到铝的毒害.

表 1 铝胁迫对油菜根系和叶面积的影响

2.2 铝胁迫对油菜根系和叶面积的影响

从表 1可以看出:华油和中双的根系总长、总表面积、总投影面积均随着铝浓度的增大而减小,在 200μmol/L铝处理时均达最小值,分别为对照组的 48.2%,77.0%,76.2%和 49.0%,88.1%,87.7%;而根系直径在铝处理浓度为 0～100 μmol/L时逐渐减小,在 200μmol/L铝处理时略有增加,但未达到显著差异水平.说明铝处理对油菜总根长、根面积等影响较大,且在铝敏感型品种上表现更明显,但对叶的面积、宽度和长度的影响均不大.

2.3 铝胁迫对油菜叶绿素荧光参数的影响

从图 2可以看出:随着铝处理浓度的增大,油菜的 Fm,Fv/F0,Yield均降低;在 200μmol/L铝处理下,华油和中双的 Fm,Fv/F0,Yield分别为对照组的 64.5%,16.7%,47.3%和 57.9%,26.5%,52.3%,且均达到显著差异水平 (P<0.05),表明在 200μmol/L铝处理下油菜的光合电子传递受到了最大抑制,且 PSⅡ潜在活性的变化极为显著;而 F0(初始荧光)的变化与上述指标的变化趋势刚好相反,在 200μmol/L铝处理下华油和中双的 F0分别为对照组的 170.5%和143.0%,表明在铝胁迫下油菜 PSⅡ反应中心受到了伤害或不可逆失活,且在铝处理浓度最高时这种伤害达到最大.铝敏感型品种的叶绿素荧光参数在铝胁迫下的变化趋势更明显,说明铝胁迫对敏感型品种的光合系统伤害更大.

2.4 铝胁迫对油菜根系酸代谢酶活性的影响

铝胁迫下,2个品种油菜根系酸代谢酶活性的变化趋势相似.图 3是以铝敏感型品种——华油为例.从图 3可以看出:随着铝处理浓度的增大,各代谢酶 (ACO,PEPC,CS和 MDH)的活性均增大,并在 200μmol/L铝处理时达最大值;且PEPC和MDH的活性在 200μmol/L铝处理时增加幅度最大,分别为对照组的 173.8%和238.9%,达到显著差异水平 (P<0.05).说明铝胁迫促进了油菜根尖的代谢水平,使其酸代谢酶活性增大.

3 结论与讨论

植物铝毒害最容易识别的形态症状就是根的生长受到抑制,肉眼可见的铝毒症状包括根伸长的抑制[14]、根尖膨大[15]、表皮脱落[16]等.由于植物根尖比成熟组织可积累更多的铝,因而根尖被认为是植物铝毒害的最初作用部位[14,17],许多作物如玉米、小麦、花生等都将根部性状作为铝毒害的评价指标[18].铝可与蛋白质、脂质、糖类和核酸等结合,干扰植物细胞内一些离子代谢,影响各种

生理生化过程的正常进行,从而抑制植物的生长.李海生等[19]研究表明:适当的铝有利于茶苗根系的生长,细根、根毛发达,但高浓度的铝抑制根的生长,铝通过作用于根生长区使植物根变短、变粗,影响根对水和养分的吸收,限制了整个植株的生长.方金梅等[20]发现:铝对决明品系幼苗的影响表现在根部,根部最早出现了铝毒的症状,表现为侧根数减少、根尖变黑,严重时侧根呈粗短弯曲形态,甚至烂根.铝毒危害的产生主要是通过阻碍植物幼苗根系的生长,使植物根系变黑、根活性降低,影响其对养分和水分的吸收,进而影响植物茎叶部的生长,因此,植物茎叶部出现铝毒症状滞后于根部[20-24].

图 2 铝胁迫对油菜叶绿素荧光参数的影响

图 3 铝胁迫对油菜根系酸代谢酶活性的影响

本实验结果与上述情况一致,铝胁迫对油菜根系有明显的抑制作用.随着铝浓度的增大,油菜的相对根长减小,而相对株高变化不大,根系总长、总表面积、总投影面积也相应地减小.在铝胁迫下,油菜耐铝型品种根系的抑制程度与铝敏感型品种相比较小,说明油菜品种间差异对铝的耐受性有所不同.

叶绿素荧光动力学技术在测定叶片光合作用过程中光系统对光能的吸收、传递、耗散、分配等方面具有独特的作用,是衡量叶片光合功能强弱的快速、无损伤的有效检测技术[25].F0的大小取决于 PSⅡ天线色素内的最初光子密度、天线色素之间及天线色素到 PSⅡ反应中心的激发能传递有关的结构状态[26].PSⅡ天线色素的热耗散常导致 F0降低,而 PSⅡ反应中心的破坏或可逆失活则能引起 F0的增加,因此,可根据 F0的变化推测反应中心的状况和可能的光保护机制[27].Fv/Fm是指暗适应样品 PSⅡ的最大量子产量,在胁迫下,随着叶绿体片层结构的逐渐降解,光化学反应效率不可避免地下降,导致光合速率下降.Fv/F0是 Fv/Fm的另一种表达方式,尽管它不是一个直接的效率指标,但是它对效率的变化很敏感,其变化的幅度比 Fv/Fm大得多,所以,Fv/F0在一些情况下是表达资料的好形式.

本实验结果表明:高浓度的铝明显地使油菜叶片的 Fm,Fv/F0和 Yield降低,表明油菜利用光能的效率下降,PSⅡ的电子传递严重受阻,热耗散增加.同时,随着铝浓度的增加,F0增大,表明被叶绿素吸收的能量转化成电能 (电子传递)的比例下降,这必然导致植物光合作用效率的降低,进而导致植物生长减慢.油菜铝敏感型品种的叶绿素荧光参数在铝胁迫下的变化趋势更明显.

铝胁迫下,植物根系分泌有机酸是植物耐铝的一种重要机理.文献 [28]的研究表明:铝处理前后大豆根端辅酶Ⅱ-异柠檬酸脱氢酶 (NADPICDH),PEPC的活性变化不大,柠檬酸合成酶(CS)的活性则比铝处理前增加了 16%.文献[29]的研究也表明:铝胁迫可以显著地提高决明根尖柠檬酸的分泌量,并且其根系内柠檬酸含量显著增加,柠檬酸合成酶活性显著提高、顺乌头酸酶活性显著降低.李德华等[30]的研究发现:铝诱导耐铝玉米自交系 Z1根系大量分泌苹果酸发生在铝处理 5 h后,即 Zl分泌有机酸应属模式Ⅱ,与铝敏感玉米自交系 Z2相比,铝胁迫下 Z1根系分泌的苹果酸量显著增加,而且根内苹果酸含量、NADP-MDH活性也显著提高.这些结果表明,根细胞内有机酸的代谢 (合成、降解)可能是调控植物有机酸分泌的重要因素.

本实验结果表明:铝胁迫下,随着铝浓度的增加,乌头酸酶、柠檬酸合成酶、苹果酸酶、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶等的活性也随之增大,并在铝处理浓度最高时达到最大值.表明在铝胁迫下油菜根系有机酸代谢加快,根尖通过增加酶活性来分泌更多的有机酸,与铝形成特定形式的螯合物,减少根系所受的铝毒害.

总之,铝胁迫对油菜根系和叶片的影响是一个逐渐变化的过程.铝首先对油菜根系造成影响,造成其相对根长减小;并进一步对油菜的叶绿素荧光参数造成影响,使 Fm,Fv/F0和 Yield等值降低,F0升高.虽然油菜的叶面积、长度、宽度等表型指标未反应其直观变化,但对其内部生理已造成一定的损害.此外,根系代谢酶活性的增加可能是油菜对铝毒的一种抗性机制.由此可推知,根系是铝毒害对油菜的作用部位,且根尖是铝毒害的原初部位,也可能是植物表现较强的对铝毒害抵抗作用的部位.

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