HPLC-UV法检测人血浆中莫西沙星的浓度

陈慧敏 赵建波 刘 涛 邱相君

(1.浙江省中医院,浙江 杭州 310006;2.杭州师范大学基础医学部,浙江 杭州 310036;3.河南科技大学医学院,河南 洛阳 471003)

莫西沙星是广谱和具有抗菌活性的8-甲氧基氟喹诺酮类抗菌药,属于第四代氟喹诺酮类药物,对革兰阳性菌、革兰阴性菌、厌氧菌、抗酸菌和非典型微生物如支原体、衣原体和军团菌有广谱抗菌活性,具有良好的药代动力学特征,目前己广泛应用于临床。关于人血浆中莫西沙星浓度检测的高效液相色谱法,国内已有报道[1-4];本实验在相关报道的基础上,建立了高氯酸沉淀法测定人血浆莫西沙星的高效液相色谱检测方法,具有操作简便,测定速度快、试剂便宜等优点,便于推广使用,为莫西沙星的临床药动学研究和临床合理用药提供方法学基础。

1 材 料

1.1 仪器 高效液相色谱仪为Agilent l100系列,包括G1379A在线脱气机,G1311A四元泵,G1313A自动进样器,G1316A温控箱,G1315B二极管阵列检测器和Agilent化学工作站[Rev A.10.02.(1757)]。电子分析天平(AB 204-A,梅特勒-托利多上海仪器公司);涡旋混合器(XK96-B,姜堰市新康医疗器械有限公司);高速冷冻离心机(TGL-16G,上海安亭科学仪器厂)。

1.2 试剂和药品 乙腈为一级色谱纯,三氟乙酸(Sigma,064K3647),高氯酸为优级纯;实验用水为娃哈哈纯净水。莫西沙星标准品(德国拜耳公司,Brx2dwfr-1004-01E);加替沙星标准品(中国药品生物制品检定所,含量 97.2%,批号 130518-200402)。

1.3 溶液配制 对照品配制:(1)准确称取莫西沙星标准品25mg于25mL容量瓶中,先用1mL冰醋酸溶解后,用双蒸水定容至25mL,得浓度为1g/L的莫西沙星标准储备液;用双蒸水稀释成浓度依次为100、10、1 mg/L的标准工作液(临用时稀释):(2)准确称取加替沙星标准品25 mg于25 mL容量瓶中,先用1 mL冰醋酸溶解后,用双蒸水定容至25mL,得浓度为1g/L的加替沙星标准储备液;用双蒸水稀释成浓度为200mg/L的加替沙星内标工作溶液。

2 方法与结果

2.1 血浆样品处理方法 准确吸取待测血浆样品0.5mL于1.5mL EP管中,加入200mg/L的加替沙星内标工作溶液25 μ L,混匀后加入35%高氯酸40 μ L,旋涡振荡20秒后,15000 rpm离心10分钟。取上清液300 μ L于自动进样器的样品瓶中,设定20 μ L进样检测。

2.2 色谱条件 色谱柱:ZORBAX Eclipse XDBC18(4.6×150mm,5μ m,Agilent,USA);保护柱:XDBC18保护柱(4.6×12.5mm,5μ m,Agilent,USA);流动相:乙腈-0.1%TFA-水(24:40:36,V:V:V):流速:1.0 mL/min;柱温:30℃;检测波长:296nm。色谱图见图1。由图可见在本实验条件下,莫西沙星与内标能完全分离,血浆中内源性物质不干扰莫西沙星和内标的检测;莫西沙星的保留时间为5.6分钟,内标的保留时间为4.0分钟。

图1 莫西沙星的高效液相色谱图A.空白血浆;B.莫西沙星(4.00mg/L)和内标血浆;C.加内标待测血样;1.内标;2.莫西沙星

2.3 线性关系及定量下限 配成浓度相当于0.05 、0.10 、0.25 、0.50 、1.00 、2.00 、4.00 、8.00mg/L 的莫西沙星空白血浆标准品溶液,再按“2.1”项处理后检测,测定莫西沙星峰面积As、内标峰面积Ai,以As/Ai为纵坐标(y),以所对应各点浓度C为横坐标(x)绘制标准曲线。得莫西沙星的标准曲线回归方程为y=0.1606x-0.0022(r=0.9999)。取标准曲线的最小浓度值0.05mg/L为定量下限(n=6;RSD=5.361%)。

2.4 精密度试验 配制低、中、高三种浓度(0.10,2.00,6.00mg/L)的莫西沙星空白血浆标准品溶液,每种浓度6份,再按“2.1”项处理后于同一日内测定,依据当日标准曲线计算检测量,计算日内精密度;连续3天同样操作,计算日间精密度,结果见表1。

表1 精密度试验结果(n=6,±s)

表1 精密度试验结果(n=6,±s)

加入量(mg/L)日内精密度(mg/L)RSD(%)日间精密度(mg/L)RSD(%)0.10 0.100±0.004 4.017 0.102±0.005 5.351 2.00 1.977±0.064 3.255 1.981±0.066 3.310 6.00 6.001±0.086 1.433 5.980±0.108 1.806

2.5 回收率试验

2.5.1 相对回收率试验 配制低、中、高三种浓度(0.10,2.00,6.00mg/L)的莫西沙星空白血浆标准品溶液,每种浓度6份,再按“2.1”项处理后检测。依据标准曲线计算各自的浓度,计算相对回收率。结果见表2。

表2 相对回收率结果(n=6,±s)

表2 相对回收率结果(n=6,±s)

加入量(mg/L) 检测量(mg/L) 相对回收率(%)RSD(%)0.10 0.100±0.005 100.333±4.546 4.531 2.00 2.057±0.042 102.867±2.077 2.019 6.00 5.998±0.095 99.967±1.591 1.591

2.5.2 绝对回收率试验 配制低、中、高三种浓度(0.10,2.00,6.00mg/L)的莫西沙星空白血浆标准品溶液,每种浓度6份,再按“2.1”项处理后检测,记录莫西沙星的峰面积,为血浆中标准品的峰面积。分别配制浓度为0.10,2.00,6.00 mg/L的莫西沙星标准品溶液,不经任何处理,取20μ L进样检测,记录标准品的峰面积。计算血浆中标准品的峰面积和不经任何处理的标准品峰面积的比值,即为绝对回收率。低、中、高三个浓度的绝对回收率分别为(72.946±1.906)%,(74.771±1.478)%,(76.902±1.132)%。

2.6 样品稳定性

2.6.1 处理后的血浆样品的稳定性 配制低、中、高三个浓度(0.10,2.00,6.00mg/L)的莫西沙星空白血浆标准品溶液,按“2.1”项处理后,分别放置12小时后检测,考察其稳定性。低、中、高三个浓度的RSD分别为2.85%、1.76%、1.46%,结果显示处理后样品在12小时内稳定,适合自动化进样检测。

2.6.2 冻融条件下血浆样品的稳定性 配制低、中、高三个浓度(0.10,2.00,6.00mg/L)的莫西沙星空白血浆标准品溶液,每个浓度2mL;放置-65℃冰箱2小时,取出解冻后再次放入-65℃冰箱中,2小时取出解冻后再次放入-65℃冰箱中。经历3次冰冻-解冻循环后,按“2.1”项处理检测,考察其稳定性。低、中、高三个浓度的 RSD分别为3.12%、1.67%、1.85%,结果显示冻融条件对血浆样品的检测结果没有明显的影响。

2.6.3 冰冻保存血浆样品的稳定性 配制低、中、高三个浓度(0.10,2.00,6.00mg/L)的莫西沙星空白血浆标准品溶液,在-65℃冰箱冰冻保存28天后,再按“2.1”项处理后检测,考察其稳定性。低、中、高三个浓度的RSD分别为2.56%、1.72%、1.93%。结果显示莫西沙星血浆样品在冰冻保存的条件下有很好的稳定性。

3 应 用

3名健康志愿者单剂量口服400mg莫西沙星片(400mg/片,德国拜耳公司生产、拜耳医药保健有限公司北京分装,批号:119209),分别在服药后1小时抽取静脉血,用该方法检测血浆中莫西沙星的浓度分别为2.342mg/L、0.762 mg/L和3.461 mg/L。

4 讨 论

莫西沙星的紫外吸收较强,整个紫外区均有吸收,三维立体图显示最大吸收波长在296nm处,故选择296nm为检测波长。预实验研究发现,莫西沙星在C18色谱柱中的保留较其他氟喹诺酮类强,在流动相中乙腈的比例18%时,左氧氟沙星、依诺沙星、氟罗沙星、加替沙星和莫西沙星能很好的分离,但莫西沙星的保留时间最长,此时的保留时间为15分钟;增加流动相中乙腈的比例为24%时,莫西沙星的保留时间为5.6分钟,而此时左氧氟沙星、依诺沙星、氟罗沙星单独做内标时,保留时间较短,血浆中内源性物质均存在干扰,加替沙星的保留时间为4.0分钟,无内源性物质干扰。故选择加替沙星为内标物质。同时发现,在乙腈比例不变的情况下,流动相中TFA的含量可以改变莫西沙星和加替沙星的峰形,TFA的比例较低时,两者的出峰有拖尾现象;当0.1%TFA比例为40%时,加替沙星和莫西沙星拖尾得到明显改善,峰形对称。

血浆莫西沙星的检测常采用高效液相色谱紫外检测的方法[2-4],也有用荧光检测的报道[1,7];采用的定量方法有内标法[1,4],也有外标法[2-3]。本研究建立的采用加替沙星做内标、血浆样品经高氯酸直接沉淀的HPLC检测血浆莫西沙星浓度的方法,操作简便,专属性高,分离完全,成本较低廉;检测时间较文献报道短,6.3分钟能完成一个样品的检测,特别适合大批量样品的自动化检测工作。血浆样品处理方法较固相萃取[3]和液液萃取[6]简单,方法回收率高,日内、日间精密度RSD均小于10%,符合药代动力学和生物等效性分析的要求。健康志愿者单剂量口服400mg莫西沙星后,血浆峰值浓度为 3.06mg/L左右[8],本方法的定量下限为0.05mg/L,能满足峰值浓度的1/20的要求。

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