熊果酸诱导人胃癌BGC823细胞凋亡及其作用机制初探

赵晓艳 胡玉娜 康向东 张隆 季青 倪振华

上海中医药大学附属普陀医院中心实验室，上海200062

胃癌是起病隐匿、发展迅速的消化道恶性肿瘤，发病率居癌症之首，死亡率占癌症的23.03%［1］。既往研究认为，肿瘤生长迅速的原因是由于癌细胞增殖快、周期短及失去控制，但近年研究发现是由于癌细胞无限制增殖及凋亡相对或绝对减少所致［2］。因此，针对这些机制的抗癌药物研发越来越受到国内外研究者的重视，尤其是中草药及其提取物的研究。熊果酸（ursolic acid，UA）又名乌索酸、乌苏酸，属于三萜类化合物，广泛存在于夏枯草、连翘、栀子和白花蛇舌草等清热解毒中草药中，具有抗炎、保肝、降血脂等多种生物学活性，于1990年被日本列为最有希望的癌化学预防药物之一［3］。UA抗肿瘤作用已有较多报道，但具体作用机制尚未见报道，本实验拟探讨UA对人胃癌细胞周期和凋亡的影响及其作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 胃癌细胞株 BGC823细胞株来自上海市普陀医院中心实验室，在含10%灭活PAA小牛血清的RPMI1640培养液中，置37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的温箱中培养传代，选取对数生长期细胞用于实验研究。

1.1.2 主要试剂 UA（Sigma公司）；RPMI-1640培养基（Gibco公司）；小牛血清（微科生物公司）；细胞周期与凋亡检测试剂盒（南京凯基公司）；680型酶标仪、凝胶成像仪、电泳仪（均为美国Bio-Rad公司）；流式细胞仪（Becton Dickison公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 MTT比色法测BGC823细胞的生长抑制率 取对数生长期细胞，制成1×108/L的悬液，按每孔200 μL接种于3块96孔培养板。24 h后加药，实验设空白对照组和阴性对照组及5种不同浓度药物组，终浓度分别为：20、40、50、60、70 μmol/L，每一浓度设8个复孔。分别培养24、48和72 h，加MTT 50μg/孔，继续培养4 h后加DMSO 200 μL/孔，酶标仪上机检测（震荡10 min，测单波长570nm处吸光值），实验重复3次。按（A阴性对照组-A加药组）/（A阴性对照组-A空白对照组）计算药物对细胞的生长抑制率及IC50值。

1.2.2 流式细胞术法检测BGC823细胞的生长周期及凋亡情况 取对数生长期细胞3 mL按200万/孔种于6孔板，24 h后依据上述IC50值分组加药，即阴性对照组（0 μmol/L）和加药组（20、40、80 μmol/L），每组3个复孔；分别继续培养24后，收集细胞，依照凯基细胞周期及凋亡检测试剂盒操作步骤进行，最终每个样品收集10 000个细胞，上流式细胞仪检测。试验重复3次，CellQuest软件进行分析，测定DNA含量和亚二倍体峰在细胞周期所占百分比。

1.2.3 Real time-PCR法检测BGC823细胞bax、bcl-2 mRNA水平 接板加药同上，24 h后Trizol法提取细胞总RNA，A260nm/A280nm处测定其浓度及纯度，1%琼脂糖凝胶电泳分析RNA完整性。以oligodT为引物逆转录合成cDNA，存于-80 ℃备用。引物和探针由上海生工合成，其序列见表1，内参采用GAPDH。Real time-PCR反应体系为25 μL：cDNA2 μL，上下游引物各1 μL，探针各1 μL，Taq酶0.5 μL，buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，Mg2+2 μL，双蒸水13 μL。反应条件为：95 ℃预变性2 min；95 ℃，30 s；58 ℃，30 s 40个循环。

2 结 果

2.1 UA对BGC823细胞的生长抑制作用 MTT测定结果表明UA呈时间-剂量依赖性抑制BGC823细胞增殖，24、48和72 h时IC50分别为36.88、34.72及32.18μmol/L（图1）。

2.2 UA对BGC823细胞周期及凋亡的影响 流式细胞术结果显示UA能诱导细胞凋亡，凋亡百分比依次为2.68%、7.79%、11.22%和19.85%；同时UA也影响细胞周期，将细胞阻滞于G2/M期，G2期所占比例依次为5.20%、5.40%、8.05%及17.83%（图2）。

2.3 对BGC823细胞bax及bcl-2 mRNA表达的影响 结果显示UA作用于BGC823细胞后，可呈剂量依赖性的上调bax及下调bcl-2 mRNA表达（图3、4）。

表1 引物和探针序列Tab.1 Sequence of primer and probe

图1 UA对BGC823细胞生长抑制作用Fig.1 The cell proliferation inhibition rate of BGC823

3 讨 论

UA主要来源于白花蛇舌草、夏枯草、连翘和栀子等清热解毒药，现代药理研究证实，清热解毒药普遍具有增强机体天然免疫力、抑制特异性免疫反应的作用，临床上被广泛应用于癌症配伍治疗。单体UA属于α-香树脂醇（α-amyrin）型五环三萜类化合物，具有广泛的生物学活性，于1990年被日本列为最有希望的癌化学预防药物之一［3］。

MTT结果表明UA呈时间-剂量依赖性抑制BGC823细胞增殖，而流式细胞术结果显示，UA可诱导BGC823细胞凋亡，并阻滞细胞于G2/M期。细胞在G1期进入S期，G2期进入M期处有控制点，若细胞DNA出现异常即被阻滞。而正常细胞DNA轻度损害时可通过内切酶等修复并进入下一周期，癌细胞则缺乏这种调控［4］。因此，UA将BGC823细胞阻滞于G2/M期，通过影响肿瘤细胞周期来抑制其增殖。

bcl-2和bax同属bcl-2家族，可调节细胞凋亡，但作用相反。bcl-2是特异性抑制细胞凋亡基因，在肿瘤患者中高表达。体外实验证实，多种因素可对bcl-2高表达进行抑制和阻断，促发细胞凋亡，明显延长肿瘤患者的生存时间［5-6］。bax的生物学作用则是拮抗bcl-2，促进细胞凋亡，两者表达水平高低与直接调控凋亡有关［7］。Real time-PCR结果显示，UA作用于BGC823细胞，可上调其bax mRNA表达，下调bcl-2 mRNA表达，且在一定范围内呈剂量依赖性。

图2 UA作用24 h对BGC823细胞周期和凋亡影响Fig.2 Effect of UA on the rate of cell apoptosis and cycle of BGC823 cell tested by Facs

图3 UA对BGC823细胞bax mRNA表达的影响Fig.3 Expression of bax mRNA in BGC823 cell treated by UA

图4 UA对BGC823细胞bcl-2 mRNA表达的影响Fig.4 Expression of bcl-2 mRNA in BGC823 cell treated by UA

本实验观察到UA呈时间-剂量依赖性抑制BGC823细胞增殖，并能诱导细胞凋亡，将细胞阻滞于G2/M期，其诱导凋亡的机制可能与上调bax mRNA表达及下调bcl-2 mRNA表达有关。但其药理作用的具体信号通路我们正在进行进一步的研究。

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