吉西他滨诱导胰腺癌细胞BxPC-3中XIAP基因表达的研究

张潜 王洪林

重庆医科大学附属第一医院肝胆外科，重庆 400016

胰腺癌是一种临床表现隐匿、进展迅速、早期诊断困难、手术切除率低、预后不良的恶性消化道肿瘤。吉西他滨（gemcitabine，GEM）已经成为进展期和转移性胰腺癌标准的一线化疗药物，并已逐渐成为进展期胰腺癌标准化疗方案用药，虽已具有很明显的临床获益，但生存优势却很低［1-2］。其原因是药物使用过程中的耐药现象影响其疗效［3］。凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis proteins，IAPs）是细胞内一类重要的凋亡抑制因子家族，包括X染色体连锁的凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis，XIAP）、神经元凋亡抑制蛋白（neuronal apoptosis inhibitory protein， NIAP）、生存素（survivin）和黑色素瘤IAP（ML-IAP，livin）等。有研究［4］指出，XIAP是IAPs家族中最有效的内源性caspases抑制因子。也有研究［5］显示，XIAP在多种肿瘤细胞中高表达，并与肿瘤的化疗抵抗相关。国内对应用GEM作用胰腺癌后，对XIAP这一重要凋亡相关蛋白的影响研究尚少，本研究旨在探讨GEM诱导胰腺癌细胞中XIAP的表达及其与化疗耐药可能的关系。

1 材料和方法

1.1 细胞株和主要试剂

1.1.1 细胞株 胰腺癌细胞株BxPC-3购于中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。

1.1.2 试剂 GEM（法国礼来公司），RT试剂盒（TAKARA公司），XIAP引物（TAKARA公司合成），兔抗人XIAP抗体、兔抗人β-actin抗体和羊抗兔IgG抗体（北京中杉生物技术有限公司分装）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养与传代 用0.25%的胰酶+0.02% EDTA的消化液消化BxPC-3细胞，用含15%胎牛血清的DMEM培养基，在37 ℃、CO2体积分数5%，饱和湿度的细胞培养箱中培养，细胞每2～3 d按1∶3传代2次。

1.2.2 B x P C-3 细胞对G E M 的中效浓度（IC50）的测定 ⑴细胞以1×104/孔接种于含200 μL上述培养液的96孔板中，在37 ℃，CO2体积分数5%，饱和湿度的细胞培养箱中培养。⑵在各孔中加入最终浓度分别为1、2.5、5、10、20和40 μg/mL的GEM 20 μL，每个浓度设6个复孔，以不加药物细胞存活率为100%的孔和没有接种细胞的试剂孔分别作为细胞对照和空白对照。⑶细胞在浓度梯度药物作用下分别继续培养24 h和48 h，每孔加入5 mg/mL噻唑蓝（MTT）溶液20 μL，继续培养4 h。⑷吸干培养基，每孔加入二甲基亚砜液200 μL，室温摇床振荡10 min使结晶充分溶解。⑸在酶联免疫检测仪570 nm波长测各孔吸光度值。⑹细胞增殖存活率（%）=［（A实验组-A空白对照组）/（A细胞对照组－A空白对照组）］×100%，根据IC50计算软件得出24 h和48 h的IC50。

1.2.3 GEM对BxPC-3胰腺癌细胞内XIAP的诱导 细胞生长状态良好时，取1×106/瓶传代接种于2个装有培养基的25 cm2培养瓶中，加入3.10 μg/mL GEM继续培养，未加入GEM的细胞作为对照组。

1.2.4 流式细胞仪分析细胞周期及早期细胞凋亡 消化各组细胞至单细胞悬液状态，300×g离心3 min去上清液后PBS清洗再离心，重复3次，70%乙醇固定4 ℃保存，以100 mg/L的碘化丙啶溶液染色后在FACSVantage SE流式细胞仪上进行检测。

1.2.5 RT-PCR检测XIAP mRNA的表达 ⑴细胞总RNA的提取：实验组和对照组细胞，消化并计数后各取1×106于EP管中，用TRIzol法提取细胞并消化总RNA，将RNA溶于25 μL DEPC水，取5 μL RNA以80 V电压下行1%琼脂糖凝胶电泳，同时稀释60倍分别测定260 nm和280 nm的吸光度值，检验纯度，以公式：RNA浓度（μg/mL）=A260nm×稀释倍数×40计算RNA浓度，立即行RT-PCR反应。⑵RT-PCR反应：RT反应体系为：5×PrimeScriptTMBuffer 2 μL，PrimeScriptTMRTEnzymeMixⅠ 0.5 μL，Oligo dT Primer（50 μmol/L） 0.5 μL，Random 6 mers（100 μmol/L） 2 μL，总RNA 4.5 μL，RNaseFree dH2O加至10 μL。RT反应条件：37 ℃15 min，85 ℃ 5 s。XIAP引物序列为：5’-CAAGTGGTAGTCCTGTTTCAGC-3’（上游），5’-GGGTTAGGTGAGCATAGTCTGG-3’（下游），扩增产物片段长度为432 bp，内参为β-actin，序列为5’-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3’（上游），5’-ACTCGTCATACTCCTGCTTGCT-3’（下游），扩增产物片段长度为272 bp。PCR反应体系为：Taq酶(5 U/μL) 0.25 μL，10×PCRBuffer (Mg2+Free) 5 μL，MgCl2(25 mmol/L)3 μL，dNTPMix (各2.5 mmol/L)4 μL，上游引物(20 μmol/L)1 μL，下游引物(20 μmol/L)1 μL，灭菌蒸馏水加至 50 μL。PCR反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s（30个循环），72 ℃ 10 min，4 ℃保存。反应完毕后，取产物5 μL以1%琼脂糖凝胶电泳，Bio-Rad凝胶电泳成像仪成像，Quantity one分析各条带吸光度值，计算XIAP的mRNA相对值。

1.2.6 Western blot检测XIAP蛋白的表达 RIPA裂解液提取细胞总蛋白，取样本20 μg上样进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳后转至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的PBS封闭1 h（4 ℃过夜）。分别加入兔抗人XIAP抗体及兔抗人β-actin抗体于4 ℃温育过夜，加入1∶1000 HRP标记的羊抗兔IgG抗体。化学发光试剂盒检测显影，凝胶成像测灰度进行数据分析。

1.3 统计处理 采用SPSS 13.0统计软件进行统计学处理，MTT结果采用多因素方差分析。流式分析，RT-PCR及Western blot检测采用单因素方差分析。多个样本间的多重比较采用SNK-q检验，检验水准α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 GEM对胰腺癌BxPC-3细胞的增殖影响 MTT法显示GEM具有显著抑制胰腺癌BxPC-3细胞增殖的作用，且随着作用时间增加及GEM浓度增加，呈明显的时间依赖性和浓度依赖性；不同浓度组间、不同时间组间的细胞存活率均有显著性差异（F=15.36，P＜0.05，表1）。

2.2 胰腺癌BxPC-3细胞对化疗药物GEM的中效浓度（IC50） MTT检测结果显示，GEM对BxPC-3细胞24及48 h时的IC50分别为1.05 μg/mL和3.10 μg/mL，细胞培养液中加入终浓度为3.10 μg/mL的GEM培养24、36、48和72 h作为实验组，以不含GEM培养的细胞作为对照组。

表1 GEM作用后BxPC-3细胞存活率Tab.1 The survival rate of BxPC-3 cells treated with different concentrations of GEM(%)

2.3 细胞周期分析及凋亡检测 流式细胞仪分析显示，3.10 μg/mL GEM作用24、36、48和72 h后，细胞被阻滞于G0/G1期，S期细胞比例降低。凋亡细胞比例随作用时间延长而增加，各实验组细胞G0/G1期细胞分别增至（47.5±2.1）%、（53.6±1.4）%、（57.2±2.0）%和（62.3±1.6）%，与对照组（2 7.6±1.3）%相比差异有统计学意义（P＜0.05）。对照组BxPC-3细胞凋亡率较低，各实验组细胞凋亡率分别增加至（10.3±1.8）%、（14.2±1.5）%、（18.8±1.7）%和（20.3±2.0）%，实验组与对照组（1.23±1.6）%相比差异有统计学意义（F=146.24，P＜0.05）；24 h与36 h组间、36 h组与48 h组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；48 h与72 h组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05，图1）。

2.4 GEM作用胰腺癌BxPC-3细胞后XIAP mRNA的转录情况 以β-actin灰度为内参照，比较β-actin与目的基因XIAP条带灰度比值。3.10 μg/mL GEM分别作用24、36、48和72 h后，各实验组较对照组上升分别为（1.05±0.03）倍，（1.07±0.01）倍，（1.12±0.01）倍和（1.43±0.02）倍，随作用时间增加而增加，与对照组相比差异有统计学意义（F=83.72，P＜0.05）；提示XIAP mRNA的转录具有时间依赖性；24 h与36 h组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05），36 h组与48 h组间、48 h与72 h组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05，图2）。

图1 细胞凋亡检测及周期分析Fig.1 Detection of cell apoptosis and analysis of cell cycle

图2 3.10 μg/mL GEM作用不同时间后BxPC-3细胞XIAP mRNA的转录Fig.2 The transcription of XIAP mRNA in the BxPC-3 cells treated with GEM at 3.10 μg/mL for variant sections

2.5 XIAP蛋白的表达 以β-actin的灰度为内参照，比较β-actin与目的基因XIAP条带灰度比值。3.10 μg/mL GEM分别作用24、36、48和7 2 h 后，各实验组较对照组上升分别为（1.82±0.13）倍，（2.04±0.18）倍，（2.60±0.12）倍和（3.95±0.06）倍，随作用时间增加而增加，不同时间组间存在显著性差异，提示XIAP的表达具有时间依赖性（F=103.58，P＜0.05）；24 h与36 h组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05），36 h组与48 h组间、48 h与72 h组间比较，差异均有统计学意义（P＜0.05，图3）。

图3 3.10 μg/mL GEM作用不同时间后BxPC-3细胞XIAP表达Fig.3 The expression of XIAP in the BxPC-3 cells treated with GEM at 3.10 μg/mL for variant sections

3 讨 论

IAPs表达上调是大多数肿瘤细胞的一个共同特征，XIAP作为IAPs家族中备受重视的成员，在包括胰腺癌在内的多种肿瘤中均呈高表达，并与肿瘤细胞对化疗药物的耐药性相关［6-7］。Shrikhande等［8］研究发现胰腺癌患者的XIAP mRNA水平是对照组的2.1倍，分析发现胰腺癌低生存率的患者有较高的XIAP mRNA水平的趋势，通过靶向XIAP的SiRNA使Capan-1和T3M4两种胰腺癌细胞增殖降低，两细胞系对GEM敏感性都得以增加。杜冀晖等［9］通过转染胞质表达型Smac基因至化疗抵抗Panc-1细胞，发现明显下调其XIAP表达，显著提高顺铂、5-FU诱导的细胞凋亡率，得出胰腺癌细胞XIAP的表达水平下调与其化疗敏感性有关的结论，认为XIAP是克服化疗抵抗的重要靶分子，而上调Smac可拮抗XIAP的凋亡抑制作用，协同化疗药物促进胰腺癌细胞凋亡。Mcmanus等［10］和Lima等［11］均通过RNA干扰（RNAi）技术阻断了XIAP后增强了癌细胞的化疗敏感性。

GEM是细胞周期特异性抗代谢类药物，主要作用于DNA合成期的肿瘤细胞，可阻止细胞由G1期向S期的进展。GEM在细胞内转化成吉西他滨磷酸盐，后者可使DNA链合成停止，进而DNA断裂、细胞死亡，从而发挥抗癌作用。

本研究结果表明，GEM具有显著抑制胰腺癌BxPC-3细胞增殖的作用，且呈明显的浓度依赖性和时间依赖性。GEM对BxPC-3细胞的24 h及48 h的IC50分别为1.05 μg/mL和3.10 μg/mL，表明细胞对GEM的敏感性随时间的增加而降低。3.10 μg/mL GEM作用胰腺癌BxPC-3细胞后，流式细胞仪分析表明：细胞阻滞于G0/G1期，并发生凋亡，且凋亡细胞比例随作用时间的延长而增加，24 h组和36 h组间、36 h组和48 h组间比较差异均有统计学意义，但在48 h组和72 h组间比较差异无统计学意义，表明胰腺癌BxPC-3细胞对GEM有药物抵抗性，并且药物抵抗性在用药约48 h左右能够表现出来。RT-PCR及Western blot结果表明，XIAP mRNA转录及蛋白表达都随着GEM作用时间增加而增加，在24 h组和36 h组间比较差异无统计学意义，但在36 h组和48 h组间、48 h组和72 h组间比较差异有统计学意义，说明GEM能诱导XIAP的增加，呈时间依赖性，XIAP表达增加可能是胰腺癌BxPC-3细胞对GEM抵抗性的表现之一。增加的XIAP可能参与并影响了GEM诱导的细胞凋亡过程，在凋亡执行过程中XIAP增加使凋亡受阻，进而促进化疗耐药得以实现。

本研究主要探讨了GEM对胰腺癌BxPC-3细胞的作用，GEM能使细胞凋亡，但随着作用时间的延长，其对药物的敏感性减低；XIAP这一凋亡抑制蛋白家族重要成员的表达随作用时间延长而增加，XIAP表达增加可能是胰腺癌细胞逃避化疗药物杀伤的机制之一，可能参与了BxPC-3对GEM的耐药性的产生，对后续针对靶向凋亡抑制因子XIAP的抗胰腺癌研究有重要意义。

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