染料木素促成骨样细胞增殖作用及其机制研究

牛银波，李宇华，黄海涛，孔祥鹤，王婷梅，梅其炳，

目前，在骨质疏松防治研究领域，通过刺激骨形成防治骨质疏松已成为研究的热点［1］。染料木素是大豆异黄酮的主要成份，研究表明［2］染料木素具有抗骨质疏松的作用，它在抑制骨吸收的同时还可以促进骨形成。

研究表明［3-4］，在骨形成过程中骨形成蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)及 Wnt/βcatenin信号通路发挥着极其重要的调控作用。BMP-2可促进骨形成和成骨细胞分化［5］。Wnt/βcatenin信号通路中的关键核心分子β-catenin在胞质中积聚转入核内时，可促进体外成骨细胞发育及体内的骨形成［6］。因此，本研究通过不同浓度染料木素对成骨样细胞增殖作用的影响及对BMP-2和β-catenin表达的影响，初步探讨染料木素防治骨质疏松症的机制。

1 材料

1.1 药物和试剂 染料木素(纯度为98%)购于西安斯诺特生物技术有限公司，雌激素(β-estradiol，E2，纯度为98%)购于 Sigma公司，小鼠MC3T3-E1成骨样细胞株购自中国科学院上海生化细胞所细胞库，DMEM培养基(Gibco公司)，胎牛血清(四季青生物制剂公司)，胰蛋白酶、EDTA、二甲基亚砜(DMSO)，MTT(均购于 Sigma公司)，ALP试剂盒(南京建成生物公司)，BMP-2(Bio worlde公司)，β-catenin及 β-actin抗体(Santa Cruz公司)。

1.2 实验分组 实验分为对照组(Control组)，雌激素组(E2，1 ×10-9mol·L-1的雌激素)，染料木素各组(1 ×10-10、1 ×10-9、1 ×10-8、1 ×10-7、1 ×10-6和1×10-5mol·L-1)，分别按浓度配制成相应含药培养液备用。

2 方法

2.1 MTT法检测细胞增殖率 取生长良好、处于对数增生期的MC3T3-E1细胞以5×106·L-1的密度接种于96孔板内，置于37℃、5%CO2培养箱中培养12 h，使细胞充分贴壁。随机分组处理，分别加入含1×10-9mol·L-1雌激素和不同浓度染料木素(1 ×10-10、1 ×10-9、1 ×10-8、1 ×10-7、1 ×10-6和 1×10-5mol·L-1)的培养液 200 μl，对照组仅加入200 μl的含0.54‰ DMSO的培养液，同时设置空白组用于调零，空白组未接种细胞，仅加入200 μl的DMEM培养液，每组设5个平行孔。将96孔板置于培养箱继续培养24、48和72 h。取出培养板，每孔加入5 g·L-1MTT溶液20 μl，再继续孵育4 h后，终止培养。弃去存留的孵育液，每孔加入150 μl的DMSO，于微量振荡仪上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。酶标仪上检测各孔570 nm波长的吸光度。计算细胞增殖率:

2.2 碱性磷酸酶(ALP)活性测定 24孔板每孔接种1×108·L-1细胞，细胞贴壁后换含1×10-9mol·L-1雌激素和不同浓度染料木素(1×10-10、1×10-9、1 ×10-8、1 × 10-7、1 × 10-6和 1 × 10-5mol·L-1)的培养液。加药24和48 h后，按照碱性磷酸酶测定试剂盒说明进行操作，采用DU800型紫外分光光度计测定各组520 nm处吸光度，计算ALP活力单位，同时测定每个样品的蛋白含量，结果用U·mg-1Pro表示。

2.3 Western blot测定 BMP-2 和 β-catenin 的表达 将对照组和染料木素各组(1×10-9、1×10-8和1×10-7mol·L-1)的细胞用细胞刮收集后加入RIPA(含PMSF蛋白酶抑制剂)细胞裂解液提取总蛋白，用Bio-Rad酶标仪进行蛋白定量。蛋白变性后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜。NC膜用5%脱脂牛奶室温封闭3 h，依次加兔抗BMP-2(1∶500)、βcatenin(1∶200)及鼠抗β-actin(1∶500)一抗室温孵育30 min后4℃过夜，TBST洗膜后加1∶5 000稀释的相应HRP标记二抗，室温孵育1 h，TBST及TBS洗膜后，进行化学发光。发光条带进行灰度分析以观察各蛋白表达水平的变化。

2.4 统计学处理 采用SPSS 11.0统计软件中的方差分析(ANOVA)进行数据统计。

3 结果

3.1 MTT细胞增殖试验检测染料木素的促细胞增殖效应 MC3T3-E1细胞经雌激素和不同浓度染料木素处理后，MTT法测各组A值。实验结果显示，与对照组相比，1×10-8、1×10-7、1 ×10-6和 1×10-5mol·L-1的染料木素作用于细胞24 h后均能促进成骨样细胞增殖(P＜0.05或P＜0.01)，染料木素作用于细胞48和72 h后，各浓度染料木素(1×10-10、1 ×10-9、1 ×10-8、1 ×10-7、1 ×10-6和 1 ×10-5mol·L-1)均能促进成骨样细胞增殖(P＜0.05或 P ＜0.01)，见Fig 1。

3.2 不同浓度的染料木素对成骨样细胞ALP活性的影响 染料木素作用于细胞24和48 h后，1×10-10mol·L-1浓度组与对照组相比ALP含量无明显变化(P＞0.05)，但随着浓度的升高，染料木素组ALP含量水平均升高，1×10-9、1×10-6和1×10-5mol·L-1浓度组与对照组相比差异有统计学意义(P ＜0.05);1×10-8、1 ×10-7mol·L-1浓度组与对照组相比差异有显著性(P＜0.01)，见Fig 2。

3.3 染料木素对 MC3T3-E1细胞 BMP-2和 βcatenin蛋白表达的影响 不同浓度染料木素(1×10-9、1 ×10-8和1 ×10-7mol·L-1)培养 MC3T3-E1细胞48 h后，通过Western blot检测MC3T3-E1细胞BMP-2和β-catenin蛋白的表达。结果表明，染料木素可使细胞中BMP-2和β-catenin表达水平升高，且呈浓度依赖性变化，见Fig 3。

Fig 1 Effect of genistein on the proliferation of MC3T3-E1 cells(n=5)*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

Fig 2 Effect of genistein on the ALP of MC3T3-E1 cells(n=3)*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

4 讨论

雌激素虽然能有效地防止老年或绝经妇女的骨丢失，保持骨量，减少骨折发生，但同时也增加了用药者乳腺癌和子宫内膜癌等的患病风险［7］。因此，寻找天然物质进行替代治疗，降低治疗带来的副作用十分必要。染料木素是豆类及其制品中含量较多的一种植物雌激素，其结构与雌激素相似，同时它具有抗骨质疏松的作用，在抑制骨吸收的同时还可以促进骨形成［8］。

成骨细胞是间质起源的单个核细胞，是骨形成的主要功能细胞，负责骨基质的合成、分泌和矿化［9］。ALP是成骨细胞分化时所分泌的酶，是其分化和功能的标志，ALP的活性反映了成骨细胞的成骨活性［10］。本实验结果表明，不同浓度染料木素作用于成骨样细胞MC3T3-E1后可促进成骨样细胞增殖和分化，其促成骨细胞增殖分化作用虽弱于雌激素，但对子宫的副作用明显弱于雌激素［7，11］。BMPs可诱导骨髓基质干细胞分化为成骨细胞，现已证明，BMPs参与调节细胞的增殖、分化和凋亡，在成骨细胞的分化过程中发挥的作用尤为重要［12］。大量临床前及临床研究表明重组的BMPs可以促进动物和人的骨组织再生。目前，BMP-2已经获准临床使用。本实验结果显示染料木素可促进BMP-2表达。Wnt/β-catenin信号通路在骨形成和骨代谢过程中发挥着极其重要的调控作用，其通路中的关键分子GSK3β的底物 β-catenin在胞质中积聚并穿梭进入核内时，可刺激Wnt信号下游一系列靶基因的转录，从而发挥调控细胞生长，促进体外成骨细胞发育及体内的骨形成［13-14］。染料木素可以上调β-catenin的表达。表明染料木素可同时通过BMP-2和Wnt/β-catenin信号通路促进成骨样细胞增殖与分化。

Fig 3 Effect of genistein on protein level of β-catenin and BMP-2 in MC3T3-E1 cells(n=3)*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control

综上所述，染料木素具有促成骨样细胞增殖、分化的作用，其与 BMP-2和 Wnt/β-catenin信号通路的激活密切相关。这将为染料木素开发成新型抗骨质疏松药物提供实验依据。

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