硫化氢对大鼠急性心肌缺血损伤后心功能的影响

刘 芳，张建新，，李兰芳，丁艳艳，张新艳

硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)的毒性作用很多年前就已被人们所认识，但近年来随着人们对H2S研究的逐渐深入发现［1－2］它在机体内发挥着广泛的生物学效应，是继一氧化氮(nitric oxide，NO)和一氧化碳(carbon monoxide，CO)之后的第3种新型气体信号分子。它作为气体小分子，具有持续产生、迅速传播和快速弥散等特点，在神经、心血管、消化和免疫等多个系统发挥着重要的生理及病理生理调节作用。越来越多的研究显示［3－7］在不同实验模型中内源性和外源性硫化氢均可发挥对心脏缺血/再灌注损伤的保护作用，而H2S在急性心肌缺血中的作用尚无定论。本研究旨在通过建立大鼠急性心肌缺血模型，观察H2S/CSE体系在大鼠急性心肌缺血时的变化及其对缺血心肌的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物与药品 ♂SD大鼠(250～300 g)由河北省实验动物中心提供。NaHS和PPG均购自美国Sigma公司;其余均为国产分析纯试剂。

1.2 方法

1.2.1 实验动物分组及模型制备 健康♂SD大鼠48只，体质量250～300 g，随机分为6组:① 假手术组(sham)、② 缺血组(ischemia)、③ 缺血+NaHS低剂量组(I+L NaHS)、④缺血+NaHS中剂量组(I+M NaHS)、⑤ 缺血 +NaHS高剂量组(I+H NaHS)、⑥ 缺血+PPG组(I+PPG)，每组8只。SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛(350 mg·kg－1)麻醉后取仰卧位固定;消毒后沿胸骨左缘3、4肋间开胸，剪开心包膜，暴露心脏，轻压胸壁将心脏挤出，在室间沟处左心耳下方穿线，结扎左冠状动脉前降支后将心脏回纳入胸腔，记录心电图，观察ST段的改变，ST段抬高≥0.15 mV表示造模成功。假手术组:只穿线不结扎;缺血组:于术后3 h时腹腔注射生理盐水(2 ml·kg－1);缺血 +NaHS 低、中、高剂量组:分别于术后 3 h时腹腔注射0.78、1.56、3.12 mg·kg－1的NaHS(用前半小时生理盐水新鲜配置，均为2 ml·kg－1)，缺血+PPG组于术后3 h时腹腔注射30 mg·kg－1的 PPG(2 ml·kg－1)。各组动物均在术后6 h时经右颈动脉插管入左心室，并连接到Powerlab/8 s八导生理记录仪上，测定心率(HR)、左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室内压上升/下降最大速率(±dp/dtmax)，并计算左室发展压(LVDP，LVDP=LVSP－LVEDP)。经右颈总动脉取血后处死、取材备用。

1.2.2 血浆中H2S含量的测定 采用去蛋白的方法测定［8］。在预先准备好的试管中加入0.5 ml 1%醋酸锌后加入0.1 ml血浆标本，振荡混匀，再依次加入0.5 ml 20 mmol·L－1对苯二胺盐酸盐和0.5 ml 30 mmol·L－1三氯化铁，室温孵育 20 min，使之充分显色。加入1 ml 10%三氯醋酸，用蒸馏水补足体积至5 ml。6 000 r·min－1离心 5 min，吸取上清液，测上清液在670 nm波长处的吸光度值，根据NaHS标准曲线计算血浆中H2S的含量，结果以μmol·L－1表示。

1.2.3 心肌组织中CSE活性的测定 采用亚甲基蓝方法［9］，取左心室前壁部分组织，在预冷的生理盐水中洗去残血，滤纸吸干。电子天平分别称量所取心肌组织质量，按10%质量体积比(W/V)加入预冷的磷酸钾缓冲液(50 mmol·L－1，pH=6.8)，用电动匀浆器制将其成匀浆后于4℃、4 000 r·min－1离心10 min，吸取上清0.3 ml做为反应液，测定心肌组织CSE活性。用分光光度计在波长670 nm处检测各样本反应后的吸光度值，组织中CSE活性以每毫克组织在单位时间内生成H2S的量表示，单位为μmol·min－1·g－1。

2 结果

2.1 实验前后心电图改变 实验前大鼠心电图基本正常，结扎冠状动脉后ST段明显抬高，ST段抬高≥0.15 mV表明急性心肌缺血模型成立。

2.2 H2S对大鼠心功能的影响 与假手术组比较，缺血组大鼠心功能指标HR、LVDP、±dp/dtmax明显降低，LVEDP明显升高(P＜0.01)。与缺血组比较，缺血+NaHS低剂量组大鼠心功能指标LVDP升高;缺血+NaHS中、高剂量组大鼠心功能指标 HR、LVDP、±dp/dtmax明显升高，LVEDP明显降低;缺血+PPG组大鼠心功能指标HR、LVDP、±dp/dtmax明显降低，LVEDP明显升高(P＜0.05或P＜0.01)。与缺血+NaHS低剂量组比较，缺血+NaHS中、高剂量组大鼠心功能指标LVDP、±dp/dtmax明显升高;缺血+NaHS高剂量组大鼠HR明显升高，LVEDP明显降低，(P＜0.05)。与缺血组+NaHS中剂量比较，缺血组+NaHS高剂量组大鼠心功能指标HR、LVDP、±dp/dtmax明显升高，LVEDP明显降低(P＜0.05)。即随着NaHS的剂量增加，急性心肌缺血后大鼠心功能逐渐改善(Fig 1)。

2.3 大鼠H2S/CSE体系变化 与假手术组比较，缺血组大鼠血浆中H2S含量和心肌组织CSE活性降低(P＜0.01);与缺血组比较，缺血大鼠血浆中H2S含量和心肌组织CSE活性均升高;而缺血+PPG组大鼠血浆中H2S含量和心肌组织CSE活性均降低(P＜0.05或P＜0.01)。与缺血组+NaHS低剂量比较，缺血组+NaHS中、高剂量组大鼠血浆中H2S含量和心肌组织CSE活性均升高;与缺血组+NaHS中剂量比较，缺血组+NaHS高剂量组大鼠血浆中H2S含量和心肌组织CSE活性均升高(P＜0.05)。即随着NaHS的剂量增加，急性心肌缺血后大鼠血浆中H2S含量和心肌组织CSE活性逐渐升高(Fig 2)。

3 讨论

近年来人们发现哺乳动物的许多细胞和组织都会产生H2S，它是一种新型气体递质，在机体内发挥着广泛的生物学效应，其主要由L-半胱氨酸在胱硫醚-β-合成酶(CBS)和(或)胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)的作用下生成［10］。生理状态下，SD大鼠血浆中的H2S 水平为 ～46 μmol·L－1［11］。H2S 可独自或与另外两种气体递质NO、CO共同调节一系列生理过程，并在许多疾病的发病机制中具有重要作用，如神经变性疾病、糖尿病、心脏病等［12］。有研究显示［13］胰岛素抵抗的大鼠体内H2S/CSE体系受到抑制，这是其形成高血压的重要因素，外源性给予H2S有助于缓解高血压。此外，内毒素性急性肺损伤时大鼠体内H2S/CSE体系下调，外源性补充H2S可减轻内毒素性急性肺损伤［14］。

在本研究中我们通过建立大鼠急性心肌缺血模型，观察H2S供体NaHS对急性心肌缺血损伤的保护作用。H2S对缺氧/复氧损伤的心脏保护作用已在细胞、离体和在体模型中得到证实，并且可减少心肌细胞坏死和凋亡，该作用机制可能与KATP通道开放有关［5－6，15－19］。阿霉素诱导的心肌病可能与内源性H2S生成减少有关，H2S可减弱脂质过氧化作用，增强抗氧化作用，抑制氧化应激损伤，从而起到保护心肌的作用［20］。本研究中我们首次证实H2S/CSE体系在急性心肌缺血中的作用，结果显示急性心肌缺血后，大鼠 HR、LVDP、±dp/dtmax明显降低，LVEDP明显升高，即心脏发展张力降低，静止张力升高，心肌收缩功能下降，心功能障碍;并且血浆中H2S含量和心肌组织CSE活性均降低。这些均表明急性心肌缺血时CSE活性降低，H2S生成减少，提示H2S/CSE体系可能参与了急性心肌缺血的发生与发展过程。

Fig 1 Effect of H2S on cardiac function in rats(n=15)

Fig 2 Changes of the content of H2S in plasma and the activity of CSE in myocardial tissue of rats(n=8)Note see Fig 1.＊＊P ＜0.01 vs sham;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs ischemia;△P ＜0.05 vs I+L NaHS;▲P ＜0.05 vs I+M NaHS.

我们根据相关文献［14，16－17］以及前期实验和预实验结果，分别在急性缺血3 h后腹腔注射0.78、1.56、3.12 mg·kg－1的 NaHS 及30 mg·kg－1的 PPG(CSE酶抑制剂)，NaHS为H2S供体，在水溶液中解离成Na+和HS－，后者与H+结合生成H2S;发现在此剂量对急性心肌缺血损伤有较好的治疗或加重作用，因此选择上述剂量分别观察了对其的影响。本研究还发现在给予急性心肌缺血大鼠NaHS 3 h后，心功能指标明显改善，心肌损伤明显减轻，且随NaHS剂量增加心肌损伤减轻明显;大鼠血浆中H2S含量和心肌组织CSE活性也均有升高，且随NaHS剂量增加有增高趋势，这就提示H2S可以减轻急性心肌缺血损伤，对缺血后心脏结构和功能有一定的保护作用。Zhu等［16］也发现在心肌梗死模型中内源性H2S生成减少，给予NaHS后H2S含量增加。

与NO类似，H2S是也一种有效的血管舒张剂，最近研究证实［21－22］它是一种新型内皮舒张因子，抑制或下调其生成均会产生相反的效应。本研究也证实了这一点，在给予H2S合成酶—胱硫醚-γ-裂解酶的抑制剂PPG后，心功能受损，心肌损伤加重，血浆中H2S含量和心肌组织CSE活性也降低。

综上所述，在大鼠急性心肌缺血H2S/CSE体系下调的情况下，给予H2S可明显减轻心肌缺血损伤，改善心功能，从而有效保护缺血的心肌。然而心肌缺血损伤是一个多渠道、多环节的复杂病理生理过程，H2S对心肌损伤保护作用的相应机制以及临床应用价值均有待于进一步深入探讨。

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