三七总皂苷对血管平滑肌细胞迁移的抑制作用及机制探讨

苏 明，温进坤，郑 斌，李会宣，2，刘 莎，付建然，张 静，韩 梅

血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的迁移是动脉粥样硬化、高血压以及冠状动脉血管成形术后再狭窄等心血管疾病的重要病理基础。在各种因素的刺激下，血管内皮细胞功能紊乱和内皮损伤、炎性细胞浸润并释放大量致炎因子和生长因子，诱导VSMC的迁移。因此，设计并应用药物阻断VSMC的迁移，是治疗心血管疾病的重要策略。

三七总皂苷(total panax notoginseng saponins，tPNS)是三七中含有的主要有效成分，包括人参皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1)、人参皂苷 Rg1(Ginsenoside Rg1)和三七皂苷R1(Notoginsenoside R1)等。研究证明，tPNS及其单体成分具有抑制心肌细胞肥大和对缺血/再灌损伤的保护作用［1-2］。基于VSMC迁移在动脉粥样硬化等心血管疾病的发生发展过程中起到重要作用，本研究重点检测tPNS对体外培养的VSMC迁移的影响，并探讨其作用的分子机制，为该药在临床中的应用提供研究依据。

1 材料与方法

1.1 三七总皂苷 三七总皂苷(血栓通注射液)由广东丽珠制药利民公司生产，批号:0903029，质量浓度:35 g·L-1

1.2 细胞培养 选取80～100 g清洁级♂ SD大鼠，取胸主和腹主动脉血管中膜用贴块法分离、培养VSMC。细胞在含体积分数为10%FBS的DMEM培养基中生长至融合后，胰蛋白酶消化传代，取3～5代细胞进行实验。各组于实验前换用含2%FBS的培养液培养24 h后进行以下实验。

1.3 伤口愈合实验 将各组VSMC接种于玻片上，待细胞生长至完全汇合后血清饥饿24 h，取出玻片，用无菌吸头在玻片上划痕。PBS洗净被刮下的细胞后，分别将玻片置于含tPNS不同浓度梯度(0、175、350、700 mg·L-1)的培养液中，以不加tPNS刺激组为对照，在倒置显微镜下照相。继续孵育24 h后取出，进行固定和结晶紫染色，于低倍镜下观察细胞伤口愈合情况。任取3个视野，计数迁移细胞的数量，以此表示细胞的迁移活性。

1.4 总RNA提取及RT-PCR 采用TRIzol从VSMC中提取总RNA。取等量RNA进行逆转录反应，并使用以下特异性引物进行PCR扩增鉴定:MMP-2 上游引物 5′-GCAACCACAACCAACTACGA-3′，下游引物 5′-CTGTCCGCCAAATAAACCGAT-3′;MMP-9 上游引物 5′-AACCCTGCGTATTTCCAT-3′，下游引物 5′-GCTGTACCCTTGGTCTGG-3′;OPN 上游引物 5′-CCGATGAGGCTATCAAGGTC-3′，下游引物 5′-ACTGCTCCAGGCTGTGTGTT-3′;GAPDH 上 游 引 物5′-CCCACGGCAAGTTCAACGGCA-3′，下游引物 5′-TGGCAGGTTTCTCCAGGCGGC-3′。

扩增条件:PCR 反应体系为 20 μl，包括 1 μl逆转录产物，上、下游引物(10 pmol)各取 2 μl，dNTP(2 mmol·L-1)1 μl，10 × PCR 反应缓冲液 2 μl，Taq DNA 聚合酶(5 U·μl-1)0.2 μl，无菌水补齐至 20 μl。

MMP-2:94℃预变性5 min，而后94℃变性30 s，53℃退火30 s，72℃ 延伸 35 s，30 个循环。再 72℃延伸10 min，扩增片段长度为369 bp。

MMP-9:94℃预变性 5 min，94℃变性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，30 个循环，之后 72℃延伸10 min，扩增片段长度为326 bp。

OPN:94℃预变性5 min，而后94℃变性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环之后，72℃再延伸 10 min，扩增片段长度为 135 bp［3］。

以GAPDH为内参照，扩增产物为606 bp。PCR扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离后，扫描成像，用凝胶成像分析系统进行密度分析。

1.5 明胶酶谱分析 本实验采用明胶酶谱法检测MMP-2及MMP-9的活性。经细胞计数标定后，分别取等量各组VSMC的培养液，在含2 mg·L-1明胶(Sigma)的SDS-PAGE中以4℃条件下恒压(120 V)电泳2～2.5 h。

电泳结束后，凝胶经25 ml·L-1Triton X-100(Sigma)漂洗3次，每次15 min，之后换为反应缓冲液(50 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.0，50 mmol·L-1NaCl，10 mmol·L-1CaCl2)，37℃孵育 9 h。

反应结束后，弃去反应缓冲液，经考马斯亮蓝染色和脱色后，采用凝胶成像系统进行密度扫描和相对定量分析。

1.6 Western blot分析 样品采集及处理同上述明胶酶谱分析，经SDS-PAGE恒压电泳(120 V)、半干式恒压(20 V)电转膜、脱脂奶粉封闭后用特异性抗OPN兔多克隆抗体(Santa Cruz)于4℃下孵育过夜，之后用特异性二抗(Santa Cruz)室温孵育2 h。洗膜后用化学发光试剂盒检测抗体结合区带。采用成像分析软件对显色区带的信号强度进行相对定量分析。

1.7 统计学处理 上述实验均重复3次，取其均值。计量资料以±s表示，所有实验数据均采用SPSS 13.0统计软件进行处理，多样本均数比较采用单因素方差分析(One way ANOVA)。

2 结果

2.1 三七总皂苷抑制VSMC迁移 伤口愈合实验结果显示，tPNS浓度在175、350和700 mg·L-1时，VSMC迁移活性较对照组降低(P＜0.05，Fig 1)。

2.2 三七总皂苷抑制MMP-2，MMP-9和OPN的表达和活性 MMP-2和MMP-9在VSMC迁移中发挥着重要的作用，为了阐明tPNS抑制VSMC迁移是否与抑制MMP-2及MMP-9活性有关，本研究通过RT-PCR和明胶酶谱分析分别检测了酶基因的表达和酶活性。RT-PCR结果显示，tPNS抑制MMP-2和MMP-9的表达(P＜0.05，Fig 2)。明胶酶谱分析显示，MMP-2和MMP-9的酶活性在相同处理条件下随tPNS剂量的增加呈降低趋势(Fig 3)。tPNS对黏附分子OPN表达的影响与MMP-2及MMP-9相似(Fig 2，4)。这些结果提示，tPNS通过抑制黏附分子表达和基质降解而抑制VSMC迁移活性。

Fig 1 The effect of tPNS on VSMC migration

3 讨论

动脉粥样硬化、高血压、血管成形术后再狭窄等临床常见心血管疾病的发生及发展与动脉管腔狭窄密切相关。大多数血管管腔狭窄都伴有新生内膜的增厚和血管壁的重塑［4］。当各种因素造成血管内皮损伤时，中膜的VSMC因失去内皮细胞保护而直接暴露于高浓度血清中，促使VSMC发生表型转化，即由收缩型转化为合成型。同时血管局部损伤部位募集的炎症细胞，释放炎症因子，促使VSMC的迁移并合成大量的细胞外基质，导致血管管腔狭窄［5-6］。因此，抑制VSMC迁移的药物在心血管疾病的防治中具有重要意义。

Fig 2 RT-PCR analysis for expression of MMP-2，MMP-9 and OPN in VSMCsA，B:RT-PCR;C:Densitometric scanning，*P ＜0.05 vs 0 mg·L-1 group;D:Densitometric scanning，*P ＜0.05 vs 0 h group

Fig 3 The effects of tPNS on MMP-2 and MMP-9 activity in VSMCsA:Zymography;B:Densitometric scanning.*P ＜0.05 vs 0 mg·L-1tPNS group

Fig 4 The effects of tPNS on OPN expression in VSMCsA:Western blot analysis;B:Densitometric scanning.*P＜0.05 vs 0 mg·L-1tPNS group

tPNS是由五加科植物三七中提取出来的药用成分，是活血化瘀药物。tPNS具有活血化瘀，通脉活络，降低血糖，调节血脂，抗氧化和抗动脉粥样硬化等药理作用。有研究表明［7］，人参皂苷Rg1能抑制小肠平滑肌收缩。当血管内皮受到各种损伤因素作用后，各种生长因子和细胞因子等刺激VSMC，促使VSMC合成并释放大量的 OPN［8-9］、MMP-2和MMP-9等成分［10］。这些蛋白水解酶和细胞外基质成分可以促进VSMC由中膜迁移至内膜，并导致新生内膜的增厚和管腔狭窄。有研究发现，在心血管疾病中，血清MMP-9水平与冠心病发病率之间有相关性［11］，血清 MMP-2、MMP-9 和 OPN 水平与 PCI术后再狭窄相关［12-13］。因此MMP-2和MMP-9与心血管疾病密切相关。本研究发现，tPNS可抑制VSMC的迁移作用。为探明tPNS抑制VSMC迁移的机制，检测tPNS对迁移相关基因MMP-2、MMP-9和OPN的表达的影响。RT-PCR结果显示，tPNS呈剂量和时间依赖性地抑制MMP-2、MMP-9及OPN基因的表达水平。明胶酶谱分析及Western blot分析表明，tPNS降低MMP-2及MMP-9的活性和OPN蛋白的水平。因此tPNS抑制体外培养VSMC迁移的作用与其抑制MMP-2和MMP-9的活性以及OPN基因的表达有关。

综上所述，tPNS具有抑制VSMC迁移的作用，该作用与抑制迁移相关蛋白OPN、MMP-2和MMP-9的表达有关。

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