女贞子多糖对淋巴瘤细胞膜抗原性的影响

李 璘，邱蓉丽，乐 巍，韩 莹，施樱樱，李寰舟

女贞子(Ligustrum lucidum Ait)是木樨科植物女贞的干燥成熟果实，性味甘、微苦、凉，归肝、肾经，具有滋补肝肾、明目乌发等功能。研究表明女贞子多糖(LLP)可以提高机体免疫功能，是女贞子的有效成分之一［1－2］。临床上女贞子常与其它中药配伍，用于治疗肿瘤及改善化疗后的白细胞减少等症状［3－4］，我们研究表明［5－6］女贞子多糖(Ligustrum lucidum Ait polysaccharide，LLP)可以抑制 S180和H22两种实体瘤生长，提高正常机体和荷瘤小鼠的免疫功能。为了进一步研究筛选女贞子多糖提高免疫力的有效部位，本文重点研究女贞子多糖及其分级组分对淋巴瘤细胞表面唾液酸含量和其对肿瘤细胞免疫原性的影响，探讨女贞子多糖体内抗肿瘤的作用机制及其有效部位，为临床用于肿瘤患者治疗提供依据。

1 材料

1.1 试剂 Hepes(北京鼎国生物技术发展中心，H3375)，PMSF(南京大治生物技术有限公司，DZ0754)，Pepstatin A(南京大治生物技术有限公司，J583)，EDTA(Amresco，0105 －100);Giemsa染液(南京建成生物工程研究所，批号:20061016)，唾液酸试剂盒(南京建成生物技术研究所，批号:2006 1014)，福氏完全佐剂(Sigma，批号:016K8900)，福氏不完全佐剂(Sigma，批号:086K8905)，牛血清白蛋白(Amresco，批号:0619S02)

1.2 仪器 超声细胞破碎仪(AD Instruments)，核酸蛋白分析仪(Beckman)，CO2细胞培养箱(Forma Scientific)，倒置显微镜工作站(Leica)，台式冷冻离心机(Beckman)，酶标仪(Molecular Devices)。

1.3 动物及细胞株 Balb/c鼠:南京大学模式动物研究中心提供，合格证号 SCXK(苏)2002－002;Yac-1细胞株:南京中医药大学中研院药理二室提供。

1.4 药物 女贞子总多糖(A)及女贞子多糖10%(B)、30%(C)、50%(D)、70%(E)乙醇分级沉淀产物(女贞子总糖水溶解后依次加乙醇至终浓度为10%、30%、50%及70%的沉淀物)，PBS配成300 mg/10 ml液，1 000 ×g，15 min 离心，取上清液，灭菌，保存备用。

2 方法

2.1 淋巴瘤细胞膜的提取 取淋巴瘤细胞Yac-1，RPMI1640培养后分组，分别加入 A、B、C、D、E 药物30 μl于细胞液中，使其终浓度为 300 mg·L－1，对照组加入等体积的PBS(NaCl 9.35 g·L－1，KCl 0.2 g·L－1，Na2HPO4·12H2O 2.85 g·L－1，KH2PO40.27 g·L－1)。培养60 h后，离心，PBS洗2次，加Cytosolic lysis buffer液(Hepes 10 mmol·L－1，NaCl 10 mmol·L－1，KCl 1 mmol·L－1，NaHCO35 mmol·L－1，CaCl21 mmol·L－1，MgCl20.5 mmol·L－1)，每瓶1 ml，孵育5 min［7］。细胞刮子将细胞轻轻刮离到Cytosolic lysis buffer中，加蛋白酶抑制剂1 mmol·L－1PMSF(1.74 g PMS·L－1异丙醇)，5 min 后加 1 μg·L－1Pepstatin A 及5 mmol·L－1EDTA。置于冰水中，超声细胞破碎仪裂解细胞(25 W，10 s开，20 s停，计30次)。涂片行Giemsa染色(80%以上的细胞裂解)，4℃离心1 000×g，10 min。取上清液4℃离心4 000×g，15 min，弃沉淀后，上清液4℃离心15 000 ×g，90 min，取沉淀，加0.1 ml蒸馏水吹散［8］。

2.2 抗体的制备 取上述各组沉淀(细胞膜)悬液，与福氏完全佐剂(1∶1)充分混匀(呈现乳白色油状液体)。取Balb/c小鼠，分别于背部皮下注射0.2 ml/只，两侧腋下淋巴结处0.1 ml多处皮下注射相应细胞悬液，每只注射0.6 ml。对照组给予等体积生理盐水与福氏完全佐剂(1∶1)的混匀液［9］。分别于14、21、25 d，细胞膜提取液与福氏不完全佐剂(1∶1)混匀，如前法进行加强免疫。末次免疫7 d后小鼠眼眶取血，1 500×g，10 min，离心血清。

2.3 血清中抗体滴度测定(间接ELISA法)包被液(NaCl 8.0g·L－1，KCl 0.2 g·L－1，Na2HPO412H2O 3.6 g·L－1，KH2PO40.24 g·L－1，pH 7.4)稀释抗原(1 ∶20)，酶标板加100 μl抗原溶液，37℃水浴1 h。去离子水冲洗酶标板，加入2%BSA，37℃水浴1 h，进行封闭。去离子水清洗3次，去除孔中残余的液体。用PBS按1∶200、1∶400、1∶800、1 ∶1 600、1 ∶3 200及1 ∶6 400比例稀释血清，每孔100 μl，同时用免疫前血清作阴性对照。去离子水清洗，加入羊抗鼠血清(1∶105)，每孔100 μl，37℃水浴1 h。去离子水清洗，去除孔中残余液体，加入 PNPP 底物液 100 μl，37℃水浴 40 min，405 nm测定。

2.4 细胞膜表面唾液酸含量的测定 将药物处理过的细胞膜及对照组细胞膜分别用0.1 ml蒸馏水吹散，制成细胞膜悬液，按试剂盒进行唾液酸含量的测定。混匀液100℃水浴15 min，3 500 r·min－1，离心10 min，上清液于560 nm测定［10］，并按下列计算公式:

唾液酸含量(mmol·g－1Pro)=(测定管OD值－空白管OD值)/(标准管OD值－空白管OD值)×标准管浓度

3 结果

3.1 女贞子多糖对血清抗体滴度的影响 女贞子多糖及其分级沉淀部位具有提高小鼠血清中抗体滴度的能力，以女贞子总多糖(A)及50%醇沉多糖(D)作用较强，10%醇沉部位(B)的作用较弱。提示女贞子多糖及其分级沉淀部位与淋巴细胞瘤作用后，可能影响细胞表面的蛋白多糖结构，暴露抗原部位，提高肿瘤细胞免疫原性，激发机体免疫系统。结果见Tab 1。

3.2 女贞子多糖对淋巴瘤细胞膜表面唾液酸含量的影响 唾液酸常位于细胞表面，为细胞与外界环境信息交流的通道之一，对细胞产生重要影响。研究结果表明:女贞子总多糖(A)及50%醇沉多糖(D)在300 mg·L－1的浓度下作用60 h，可以降低淋巴瘤细胞Yac-1细胞膜表面唾液酸的含量，与PBS比较差异有显著性(P＜0.05)，结果见Tab 2。

Tab 1 Effects of LLP on serum antibodies in mice immunized by lymphoma membrane

Tab 2 Effects of LLP on sialic acid in lymphoma membrane(±s，n=3)

Tab 2 Effects of LLP on sialic acid in lymphoma membrane(±s，n=3)

*P＜0.05 vs control

Group Dose/mg·L －1 SA/mmol·L －1 PBS － 0.2850 ±0.0950 A 300 0.1360 ±0.0333*B 300 0.1676 ±0.0378 C 300 0.1651 ±0.1832 D 300 0.1580 ±0.0263*E 300 0.1979 ±0.1634

4 讨论

唾液酸是以吡喃形式存在的酸性氨基糖，为多种天然神经氨酸衍生物中的一种。其氨基被乙酞基、羟乙酰基或羟基被乙酸基、乳酰基、硫酸基或磷酸基酯化，呈现多样性。唾液酸与细胞表面蛋白结合，形成一系列的糖缀合物。糖缀合物由蛋白质及糖两部分组成，糖位于生物细胞的表面，为病毒、细菌及植物和细菌毒素的特异性受体，并作为自身免疫和异体免疫反应的抗原。在大多数情况下，涉及的糖系列有高度特异性，糖缀合物即参与抗体形成，同时对细胞外层具有保护作用。肿瘤的转化和恶性进程伴随细胞表面唾液酸量、连接方式和类型的显著变化［11－14］。许多肿瘤特异性抗体都是针对糖抗原表位，同时肿瘤细胞表面的糖层也为其免疫逃避起到保护作用［15］。唾液酸是细胞膜表面负电荷的主要来源，参与细胞表面多种生理功能，影响细胞膜表面电荷磁性、抗原决定簇的暴露、物质转运过程、膜表面受体功能等。近年许多学者报道恶性肿瘤患者、心血管疾病患者、某些炎症患者的SA升高，国内学者对唾液酸持续升高来诊断肿瘤的研究已逐渐确定，认为它可以作为早期肿瘤的筛选指标［7］。我们已有的研究结果表明［6，16］，女贞子多糖可以提高荷瘤小鼠免疫力，影响肿瘤细胞黏附能力，具有抗肿瘤作用。

为进一步筛选其有效部位及研究作用机制，本文采用女贞子多糖及其不同分子量多糖作用于淋巴细胞瘤细胞后，提取细胞膜的膜性成分，测定唾液酸含量;同时用细胞膜提取物免疫小鼠，测定小鼠血清抗体的变化。研究结果表明，女贞子总多糖(A)及50%醇沉多糖(D)提高小鼠血清的抗体滴度，促进小鼠抗体产生，提高免疫力;同时也降低淋巴瘤细胞膜表面唾液酸酶的含量，提示女贞子多糖及其分级沉淀部位抗肿瘤作用可能是通过降低肿瘤细胞膜表面唾液酸的含量，使肿瘤细胞膜表面蛋白抗原充分暴露，提高肿瘤细胞的抗原性，使机体免疫系统更易识别肿瘤细胞，从而得到抗肿瘤作用。

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