FISH在唐氏综合征产前诊断中的应用价值

第四军医大学西京医院妇产科(西安 710032)

陈必良 张建芳 赵海波 燕 凤 宋 晖 刘淑娟

唐氏综合征(Down syndrome)又称 21三体综合征,是由于21号染色体数目异常引起的常染色体病,新生儿发病率为1/700～1/800。临床表现为智力低下、精神体格发育迟滞,并伴有其他严重的先天缺陷[1]。目前,对于此病尚无有效的治疗手段。因此,在孕期能及早、准确的做出诊断、防止患儿出生是降低患病率的重要措施。通过取绒毛、羊水或脐血培养,对分裂中期细胞进行核型分析是目前产前确诊唐氏综合征的常规方法。但该方法耗时长,且培养过程中易因污染或操作技能等原因导致失败而无法分析。我们应用近几年发展起来的荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)技术对40例羊水和10例绒毛进行FISH分析,探讨其在唐氏综合征产前诊断中的应用价值。

资料与方法

1 标本羊水:共 40例,全部为在我科就诊的有产前诊断指征(包括唐氏筛查阳性、高龄、胚胎发育迟缓、育有 21三体儿等)的孕妇,年龄 24～44岁,孕龄16～32W。B超引导下经腹部抽取羊水15ml,10ml细胞培养,5ml羊水准备FISH,羊水细胞离心后备用。绒毛:10例孕 50～70d,有产前诊断指征,年龄在 25～34岁的孕妇,其中 3例育有 21三体儿,5例有不良孕产史(反复流产、畸胎、死胎、胎儿先心病等),2例为停止发育的胚胎组织。经B超定位后无菌操作,经阴道取少量绒毛。

2 试剂和设备 甲酰胺,汕头市西陇化工厂;NP-40,美国 Amresco公司;胶原酶 B,SIGM A公司;胃蛋白酶,SIGMA P7000;标记红色荧光的DSCR2探针杂交于21q22的唐氏关键区,标记绿色荧光的对照探针 DLEU1杂交于13q14,以及DAPI染料均由金菩佳公司提供。荧光显微镜,奥林巴斯 BX51;图像分析系统,美国 Applied Imaging公司;微量加样器,德国Eppendoff公司;水浴箱,上海东星建材实验设备有限公司。

3 方 法(1)羊水标本制备:羊水 2～5ml,离心1000 rpm,10min,去上清,留沉淀 0.2m1。离心管中加入5ml预温的0.075mol KCl,在 37℃水浴中低渗10min。离心,1000 rpm l0min,去上清。加入新配制的固定液(甲醇∶冰醋酸=3∶1)固定 30min。滴片,自然干燥后置-20℃冰箱冻存。(2)绒毛标本制备:绒毛5～10mg经生理盐水清洗后,在解剖显微镜下仔细挑选绒毛枝。在绒毛中加入0.5%胰蛋白酶 /PBS液,在37℃中处理 30min。用 RPMI 1640培养液洗涤绒毛10min。加入0.075mol KCl。在 37℃中低渗 15min。60%冰醋酸解离。标本置固定液中处理30min。滴片,自然干燥后-20℃保存备用。(3)杂交程序:将制备好的羊水、绒毛玻片自冰柜中取出,依次放入70%、85%、100%乙醇中脱水。室温干燥。预处理好的玻片置73℃,70%甲酰胺 /2×SSC中5min。两种探针混合液 10μl加在玻片的靶区域,盖上盖玻片,避免产生气泡(暗室中操作)。橡皮水泥将盖玻片封好。置暗湿盒中 37℃杂交过夜。(4)杂交后清洗(在暗室中):去掉盖玻片。0.4×SSC/0.3%NP-40,在 71℃中洗 2.5 min。2×SSC/0.1%NP-40,在室温下洗 1min。空气中干燥。加6μl DAPI复染。在靶区域加盖玻片。室温15min后即可观察。(5)结果判读:在镜下观察杂交效果,每例标本计数 100～200个细胞,记录杂交信号数目并采集图像。要求细胞核膜必须完整,核内杂交信号明亮清晰无重叠,信号弥散及微弱均不作统计。如果出现2个或3个荧光信号,两个位点之间距离大于单个信号的直径以上,且荧光强度相近,计为含有2条或3条染色体。如果两个信号之间的距离小于1个信号的直径则计数为1条染色体。对于21三体的确认以≥60%的细胞显示 3个红色杂交信号为诊断标准。

结 果

1 羊水细胞分析结果 40例中羊水中,发现 2例21三体综合征。其中1例为标准型21三体,来自一位26岁的孕妇,本次为第三次妊娠,超声发现胎儿为先天性心脏病,完全型房室管畸形合并房间隔卵圆孔未闭。另1例为嵌合体,来自一位 40岁的孕妇,超声发现胎儿多发性畸形。FISH图片见附图。其余 38例均正常。与染色体核型分析完全一致。

附图 羊水细胞 FISH检测照片

2 绒毛标本分析结果 10例绒毛标本 FISH分析没有发现21和13号染色体数目异常。2例绒毛培养后没有发现中期细胞,未能进行核型分析。其余7例核型分析结果与FISH分析结果相符。

讨 论

羊水培养及核型分析已广泛应用于染色体结构和数目异常的产前诊断,但是这一技术不仅需要繁琐和长的培养周期,而且由于受多种因素影响,培养的最终结果并不一定能满足核型分析的要求。FISH是近几年来由细胞遗传学、分子遗传学及免疫学技术相结合而产生的一种新技术,在遗传学领域里的基础研究或应用学科中都日益受到关注。特异DNA探针可以与相应的染色体进行杂交,在细胞核中能观察到独立的特异信号。FISH技术与传统的细胞遗传学方法比较,最大的优势在于不仅可用于中期染色体的检测,而且可以用于间期核染色体的检查。因此FISH用于产前诊断染色体数目异常,具有极大的优越性[2,3]。

我们采用的DSCR2探针,杂交于21q22的唐氏关键区,DLEU1探针杂交于13q14。两个探针可以互为对照,可同时检测这两个染色体的数目异常。而且唐氏综合征主要是由于21q22.2-q22.3的额外复制造成。运用DSCR2特异性探针进行 FISH分析,不仅可以在未培养细胞间期核中快速、准确诊断典型的21三体,还可以在正常二倍体中检测出部分三体型的患者,是进一步研究不明原因智力低下和更加准确产前诊断唐氏综合征的可靠方法[4,5]。

我们对 40例羊水细胞和10例绒毛组织标本进行FISH分析,标本仅需用 2～5ml羊水或 5～10mg绒毛,24～48h即可作出诊断。实验结果均与染色体分析相符。所以FISH技术的应用,不仅省去了细胞培养时间、缩短了诊断周期,又以快速、准确、灵敏度高、特异性强的突出特点弥补了长期以来仅依靠细胞遗传学产前诊断的不足和局限性,减少了因培养失败带来的烦恼,是一种应用前景非常好的产前诊断技术。

[1] 梁永昌,陈 敏,刘严德光,等.产前诊断中常见染色体异常的快速诊断 [J].中国实用妇科与产科杂志,2008,24(02):98-101.

[2] 邹 刚,段 涛.产前诊断胎儿非整倍体的分子生物学方法进展 [J].中国妇幼健康研究,2007,18(01):74-77.

[3] 田玉姣,岳天孚.唐氏综合征的产前诊断分子技术研究进展 [J].国际妇产科学杂志,2008,35(01):12-15.

[4] Leclercq S,Lebbar A,Grange G,etal.Optimized criteria for using fluorescence in situ hybridization in the prenatal diagnosis of common aneuploidies[J].Prenat Diagn,2008,28(4):313-318.

[5] Hsieh LJ,Hsieh TC,Yeh GP,etal.Prenatal diagnosis of a fetus affected with Down syndrome and deletion 1p36 syndrome by fluorescence in situ hybridization and spectral karyotyping[J].Fetal Diagn Ther,2004,19(4):356-360.