神经生长因子对瘢痕成纤维细胞影响的实验研究*

昆明医学院第一附属医院整形外科(昆明 650032)

袁瑞红 刘 流△ 赵德萍▲ 徐宏慧 孙家平 王福科 刘 垠

病理性瘢痕在临床上发病率有上升的趋势,随着人们生活质量的提高,越来越受到人们的重视。目前比较一致的看法是瘢痕疙瘩是一个复杂的病变,与许多基因相关[1,2]。表皮角质形成细胞之间的相互作用和真皮成纤维细胞在调节和稳态瘢痕形成中发挥重要作用,瘢痕疙瘩和增生性瘢痕是相同的过程中的两个不同阶段[3,4]。近年的大量研究已表明,创伤部位细胞的多样性和合成活性由各种生长因子调节,即生长因子参与了创伤修复的调控过程。生长因子大量释放,迅速扩散,并被蛋白酶降解,新的生长因子又从趋化而来的细胞中合成,另外,细胞间基质也影响生长因子的作用,影响其溶解性及储存。因此,在创伤修复的一系列过程中,生长因子起着关键性的作用。神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)可由多种细胞分泌合成,如炎性细胞、修复细胞等,其生物学作用具有多样性,均与创伤修复过程有密切关系,但其作用机制尚不明了。我们通过动物实验研究了NGF对瘢痕成纤维细胞的影响,现报道如下。

材料和方法

1 实验动物 成年健康 Sprague-Dawley(SD)大鼠 4只,雌雄各半,体重300±10g。

2 方 法 ①动物分组:将4只SD大鼠随机分为NGF组(n=2)及空白对照组(n=2),每组又随机分为7d、10d两个时间组(n=1)。②动物模型:用 3%戊巴比妥钠以 0.1ml/100g体重行腹腔注射麻醉,将鼠背剪毛,无菌条件下在鼠背部沿脊柱两侧各作三个直径 1.5cm的圆形全厚皮肤缺损,建立大鼠全厚皮肤缺损模型。实验侧沿创面基底注射NGF(0.33μg/ml),对照侧注射无菌生理盐水,剂量均为0.5ml,每天注射1次,设空白对照,不用任何药物。分别于手术后7d、10d处死各组动物,取材。③标本病理染色:中性甲醛液固定组织,酒精梯度脱水,透明,石蜡包埋,石蜡切片,厚度 3～5μm。行 HE染色、Cason氏改良三色染色(此法系Mallory氏染色法的改良,染色效果与Mallory氏染色法基本一致)、Hamason-Lushbangh氏染色(此法特点是利用银溶液和其它多种染料将网状纤维、胶原纤维和弹力纤维分别显示出来,故又称为三种纤维的联合染色,染色效果较好)。④标本电镜观察:LKB-Ⅴ型切片机切片后柠檬酸铅-醋酸铀双染色,JEM-100CX透射电镜观察、摄片、记录。

结 果

1 动物模型标本病理染色观察 对照组:7d组,胶原纤维排列疏松,平行排列,其间见少许成纤维细胞和少许微血管,皮肤附属器消失。10d组更明显(图1,3)。NGF组:7d组,胶原纤维排列紊乱,沉积较少,其间见大量成纤维细胞和部分新生微血管,真皮内可见大量炎性细胞浸润;10d组胶原纤维沉积增加,炎性细胞浸润减少,其它改变不明显(图2,4)。

图1 对照组 7d:胶原纤维平行于表皮排列,微血管数量减少,表皮增厚(LM×40)

图2 NGF组7d:表皮层增厚,胶原纤维排列紊乱,真皮 内有大量炎性细胞浸润,微血管数量增多(LM×40)

图3 对照组 10d:大量胶原纤维沉积,排列紊乱,上皮钉突消失,上皮层增厚(LM×40)

图4 NGF组 10d:胶原纤维增多,排列紊乱,炎性细胞浸润少见,微血管丰富(LM×200)

2 动物模型标本超微结构观察 空白对照组:7d组表皮未见明显异常,皮下结缔组织,胶原纤维排列致密,其间见较多毛细血管,胶原纤维间见少许成纤维细胞,且胞质欠丰富,部分成纤维细胞粗面内质网轻度扩张;10d组可见胶原纤维间较多梭形纤维细胞,胞质少,胞质内见少许粗面内质网及线粒体,部分线粒体肿胀嵴溶解。NGF组:7d组,上皮下见大量成纤维细胞,细胞胞质丰富,胞质内见大量粗面内质网,部分粗面内质网扩张,胶原纤维排列较疏松;10d组,胶原纤维排列较疏松,其间见较多成纤维细胞,成纤维细胞胞质丰富,胞质内见大量粗面内质网,部分内质网扩张明显,局部见部分纤维细胞,纤维细胞呈梭形,胞质内见少许粗面内质网,局部见炎性细胞。

讨 论

机体软组织受创后,首先发生的是局部炎症反应,在这一过程中中性白细胞浸润,单核细胞参与组织碎片移出,继而出现肌纤维母细胞、纤维母细胞、血管母细胞以及胶原等成分的增生,局部血运增加等病理生理反应,在这一系列变化中,NGF可以起一定的调节和促进作用,如果将 NGF注入到鼠背部的皮下创面,可以观察到不同种类的炎症细胞在组织受损部位的聚合显著增加,首先是多形核白细胞,其次为单核细胞,再其次为成纤维细胞。NGF趋化和促进创面炎症反应的特点和每一种细胞聚集峰值的大小与注入NGF的浓度呈正比。实验表明,增生性瘢痕中存在NGF的异常高水平表达,且 NGF创面上皮化后仍可趋化、活化炎性细胞,并促进其增殖及脱颗粒。因此推测,增生性瘢痕内异常高水平的NGF能通过趋化、活化炎性细胞而启动病理性胶原代谢。

有实验表明,羊膜基底有大量的神经生长因子、转化生长因子-β1和神经生长因子受体的表达。此外,除了神经生长因子的存在,可以大大增加TGF-β1的产生和释放[5]。现在有学者提出“神经源性炎症假说”,即过度的神经生长因子可诱导感觉纤维过度释放神经肽,从而导致神经肽的积累,即使在没有机械应力的作用下,仍然能导致瘢痕疙瘩和增生性瘢痕的形成[6]。神经生长因子在治疗不同原因造成的溃疡(角膜溃疡、褥疮、病毒感染、化学烧伤)时,可能缩短恢复进程,是因神经生长因子和(或)神经营养因子不同时间过程的受体(NGRF)/大鼠 p75(非编码区)的表达,可能调节最后进程。因此,神经生长因子的潜在亲愈合能力可能调节愈合过程中的一些病理变化[7]。局部应用神经生长因子可改善韧带愈合促进再生和血管生成,并导致瘢痕增强韧带的力学性能[8]。在心梗瘢痕愈合的研究中显示,受损的疤痕在的地塞米松治疗愈合后,衰减的瘢痕肌成纤维细胞增殖及神经生长因子的表达,有助于减少梗塞区域的神经反应[9]。有学者应用基因芯片技术研究显示,在瘢痕疙瘩与正常皮肤中,有高表达的转化生长因子-β(1)和神经生长因子[10]。

大鼠标本病理形态学观察结果示,7d时,瘢痕组织内大量炎性细胞浸润,胶原纤维排列紊乱,其间血管丰富,10d时,炎性细胞浸润减少,胶原纤维形成较多,排列紊乱。标本电镜观察结果显示,两个时间段瘢痕组织内见大量成纤维细胞,细胞胞质丰富,见大量粗面内质网,部分粗面内质网扩张明显。以上结果显示,在创伤修复过程中,NGF促进了炎症细胞的聚集,同时还促进了成纤维细胞的增殖,从而促进创伤的愈合,但过量应用也将导致病理性瘢痕的形成。

[1] Chen W,Fu XB,Ge SL,etal.Development of gene microarray in screening differently expressed genes in keloid and normal-control skin[J].Chin Med J(Engl),2004,117(6):877-881.

[2] Hu ZF,Gao JH,Li W,etal.Differential gene expression profile of keloids:a study with cDNA microarray[J].Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao,2006,26(3):308-312.

[3] Kose O,Waseem A.Keloids and hupertrophic scars:are they two different sides of the samecoin?[J].Dermatol Surg,2008,34(3):336-346.

[4] Scheithauer M,Riechelmann H.Basic Mechanisms of Cutaneous Woundhealing[J].Laryngorhinootologie,2003,82(1):31-35.

[5] Coassin M,Lambiase A,Micera A,etal.Nerve growth factor modulates in vitro the expression and release of TGF-betal by amniotic membrane[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol,2006,244(4):485-491.

[6] Akaishi S,Ogawa R,Hyakusoku H.Keloid and hupertrophi scar:neurogenic inflammation hypotheses[J].Med Hypotheses,2008,71(1):32-38.

[7] Micera A,Lambiase A,Stampachiacchiere B,etal.Nerve growth factor and tissue repair remodeling: trk A(NGFR)and p75(NTR),two receptors one fate[J].Cytokine Growth Facror Rev,2007,18(3-4):245-256.

[8] Mammoto T,Seerattan RA,Paulson KD,etal.Nerve growth factor improves ligament healing[J].J Orthop Res,2008,26(7):957-964.

[9] El-Helou V,Proulx C,Gosselin H,etal,Dexamethasone treatment of past-MI rats attenuates sympathetic innervations of the infarct region[J].J Appl Phusiol,2008,104(1):150-156.

[10] Chen W,Fu X,Sun X,etal.Analysis of differentially expressed genes in keloids and normal skin with c DNA microarray[J].JSurg Res,2003,113(2):208-216.