迪卡蛋鸡J亚群禽白血病继发感染葡萄球菌的诊断

王彦红,朱陈娟,刘慧谋,张小荣,刘秀梵

(扬州大学兽医学院,江苏 扬州 225009)

1989年Payne L N首次从肉种鸡中分离出J亚群禽白血病病毒(ALV-J),国内也有从肉用鸡和商品鸡等分离出该病毒的报道[2-4]。ALV-J可通过垂直传播和水平传播感染鸡群,导致很高的死亡率、肿瘤发生、生产性能降低等,造成严重损失。同时ALV-J感染鸡群后,导致其他疾病的发生。禽葡萄球菌病多由金黄色葡萄球菌引起,在60日龄以下的雏鸡以败血症型和脐炎型为主,中雏多以皮肤病为主,成年鸡易发生关节炎和关节滑膜炎[1]。本病例为J亚群禽白血病继发感染葡萄球菌,诊断结果汇报如下。

1 材料与方法

1.1 发病情况 2009年12月安徽天长某养殖户饲养2 500只90日龄的迪卡蛋鸡,个别鸡出现消瘦,并有零星死亡,病程已有10 d,死亡率约2%～5%。送检5只病死鸡和2只病鸡,送检鸡的翅下、翅尖、背部等多处有大小不一的皮肤充血、坏死等现象,这些部位的羽毛易脱落,去除患部羽毛后可见皮肤呈红紫色,皮下有较多胶冻样渗出,胸肌肌肉出血。剖检后主要病理变化是肾苍黄并严重坏死,肝、脾及心等主要组织器官无明显病变。根据病史和典型剖检病变,初步诊断为坏疽性皮炎,对本病进行病原检测。

1.2 病毒学检测 采集2只病鸡的血样分离出血清,取500μL加入 92μL的10%SDS混匀,再加入8μL蛋白酶K(终浓度200 mg/L),55℃金属浴30 min。然后加入600μL的酚∶氯仿,剧烈振荡混匀,12 000 r/min离心5 min,取上清后加入2倍体积的无水乙醇,-20℃放置20 min以上,12 000 r/min离心10 min,去上清,70%乙醇洗涤 2次,干燥后加入30μL RTE,37℃水浴 1 h后,贮存于-20℃备用。以提取DNA为模板,根据 ALV-J原型株HPRS-103的gp85囊膜糖蛋白基因序列设计一对引物[5],用PCR扩增目的片段。PCR反应体系为50μL,其中含1×PCRBuffer,2.5 mmol/L MgCl2,200μmol/L d NTPs,上下游引物浓度各为1.0μmol/L,模板为1 ng◦IU DNA 聚合酶;扩增条件为95℃预变性4 min,94℃变性1 min,55℃复性45 s,72℃延伸60 s扩增30个循环;72℃后延伸8 min,4℃保存。循环结束后,取PCR反应产物通过0.8%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

1.3 细菌学检测 将病死或病鸡的皮下渗出液、血液、肝等以无菌操作在血液琼脂平板进行划线,并采用了厌氧和有氧培养两种方式,经37℃24 h培养观察结果,对培养出的菌落涂片,分别用革兰染色,然后镜检。挑取典型菌落在血液琼脂平板、普通营养琼脂平板和LB平板上进行纯培养,将纯培养的细菌进行糖发酵等生化试验。

1.4 药敏试验 采用纸片琼脂扩散法,药敏纸片系杭州天和微生物试剂有限公司产品,操作方法和判定标准参照该公司操作方法与标准。药敏纸片有：亚胺硫酶素、妥布霉素、环丙沙星、青霉素、丁胺卡那霉素、羧苄青霉素、链霉素、菌必治、新霉素、美洛西林、洁霉素、多粘菌素、氨曲南、奥格门汀、复方新诺敏、庆大霉素。

2 结果

2.1 病毒学检测 2只病鸡血液中血清经分离后,提取DNA后,经PCR扩增出约930 bp的目的片段,与预期的目的片段大小一致(图1),因此,血清中含有ALV-J。

2.2 细菌学检测 在厌氧和有氧培养条件下,病死或发病鸡的血液和肝等病料无菌取样后在血液琼脂平板上均未有细菌生长,皮下渗出液在血液琼脂平板上均出现白色的圆形菌落,而且生长良好,革兰染色后观察为革兰阳性球菌,呈葡萄串状排列。在普通营养琼脂平板和LB平板上生长良好,在血液琼脂平板上呈β-溶血。生化试验结果显示,该菌能分解乳糖、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖,产酸不产气;能分解甘露醇,产酸。细菌生长特点、形态及生化试验结果表明该分离菌为葡萄球菌。

2.3 药敏试验 药敏试验结果显示,分离菌仅对丁胺卡那霉素和美洛西林敏感;对菌必治介于敏感和耐药之间,对其余药物均耐药。

图1 gp85基因的PCR产物电泳图

3 讨论与小结

根据本病的典型剖检病变,初步诊断为坏疽性皮炎,对送检病例进行病原分离和快速诊断方法进行实验室诊断,经病毒学检测和细菌学检测结果显示该病鸡为J亚群禽白血病继发感染葡萄球菌。迪卡白系蛋鸡产蛋性能好,养殖户用它生产非免疫胚,效益比普通蛋鸡更高,但是它作为引进品种在抗病力上比中国本土品种要差得多,更易感染J亚群禽白血病。虽然各个种禽公司加强禽白血病的净化工作,但在我国养禽业高度发展,随着各种商品鸡的J亚群禽白血病发病率增高[3-4],给禽白血病净化工作增加了难度,对该病的流行控制也提出了新的要求。目前国内外建立了多种ALV-J检测方法,本室在Smith L M等[5]研究基础上建立了快速诊断ALV-J的PCR方法,能对临床病例快速高效地进行检测。

葡萄球菌在临床上引起鸡败血症型和关节炎型的情况较为常见,但是坏死性皮炎的病例较为少见,在本病例中由于病鸡感染ALV-J后免疫力下降而继发感染此细菌,分离菌已对青菌素、庆大霉素等药产生耐药,该病治疗较为困难,建议对鸡群进行检测,已感染ALV-J病鸡及时淘汰。

[1] 陈溥言.兽医传染病学[M].5版.北京：中国农业出版社,2006：152-155.

[2] Payne L N,Brown S R,Bumstead N,et al.A novel subgroup of exogenous avian leukosis virus in chick ens[J].Journal of General Virology,1991,72：801-807.

[3] 杜岩,崔治中,秦爱建,等.从市场商品肉鸡中检出 J亚群禽白血病病毒[J].中国家禽,1999,1：1-4.

[4] 徐镔蕊,吕艳丽,董卫星,等.鸡骨髓细胞瘤病的病理学诊断[J].畜牧兽医学报,2002,33(6)：562-564.

[5] Smith L M,Brown S R,Howes K,et al.Development and application of polymerasechain reaction(PCR)tests for thedetection of Subgroup J Avian Leukosis Virus[J].Virus Res,1998,54(1)：87-98.