水貂源牛分枝杆菌的分离与荧光PCR鉴定

王春雨，杨 莉，王全凯，王海军，刘金华，周 亮，王振国（.吉林农业大学，吉林长春 308；.吉林出入境检验检疫局，吉林长春 3006）

水貂作为主要毛皮动物，在我国北部地区广泛养殖，每年产皮数百万张，年经济产值达亿元，是特种动物养殖业的主要支柱[1]。由于各地区养殖规模大小不一，管理水平良莠不齐，对水貂疾病的防治的能力和条件普遍较差，难以保证实际生产对疾病防控的要求。水貂结核病在上世纪就被世界动物卫生组织（OIE）报道[2]，水貂的养殖密度较大，配种时需要人工协助，结核病一旦发生就可能大范围流行，并威胁到养殖人员健康，进而影响社会公共卫生安全。

结核病是一种慢性人兽共患传染病，其潜伏期长，检疫和诊断的研究进展缓慢。目前结核病的诊断主要还是靠临床症状和涂片染色以及细菌培养[3]，由于结核杆菌生长速度慢，所以菌种的鉴定，费时、费力、敏感性差 ，不利于结核病的净化。荧光探针PCR是近期开始流行的一种微生物检测技术，具有准确性高、重现性好等特点，已广泛用于基因表达、病原体检测等诸多研究领域[4-6]。本研究采用荧光探针PCR对水貂源牛分枝杆菌进行鉴定，可以缩短检测时间，有利于水貂群中结核病的及时控制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 大连某貂场死亡水貂10只，ELISA检测结核阳性。

1.1.2 标准菌株 人型结核分枝杆菌 H37Rv （（M.tuberculosis，ATCC25618）、牛分枝杆菌（M.bovis，ATCC19210）、草分枝杆菌（M.phlei，ATCC607）、耻垢分枝杆菌（M.smegmatis，ATCC607），胃分枝杆菌（M.gastri，ATCC15754），购自北京中原经贸公司（ATCC菌种保存中心中国代理）。

1.1.3 主要试剂与仪器 7H9培养基、7H10培养基、OADC增菌剂均购自美国BD公司；Ex 2×Taq酶购自宝生物工程（大连）有限公司；ABI7000实时荧光PCR仪为美国应用生物系统公司产品；超纯水器Mill—Q Elix 10购自Millipore公司。

1.1.4 引物、探针的设计与合成采用Primer Express2.0软件，设计荧光PCR探针和引物。根据GenBank登录的结核杆菌RD1编码区设计合成引物及探针，5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ-1（上游引物GGCTTCTGACCCGCTAATAC，下游引物ACGTGACATTTCCCTGG ATT，探针 CCGCGAAATTCCACTG CTGC）；根据牛分枝杆菌基因组中特有序列（GenBank No：AJ003103） 设计合成引物及探针，5’端标记HEX荧光基团，3’端标记BHQ-1（上游引物GTCATGACGCCTTCCTAACC，下游引物CTCCAAGAGTGTTGCG CTT，探针 TGAATTCATACAAGC CGTAGTCGTGCA）。

1.2 方法

1.2.1 细菌分离培养 采集水貂的肺、脾、淋巴结样品，将样品进行匀浆处理后使用4%NaOH进行消化处理，再用相同浓度的弱酸进行中和，将处理后的组织浆液接种于7H10培养基进行分离培养，接种后3 d、7 d后分别观察结果一次，以后每周定期观察结果两次。

1.2.2 抗酸染色 取采集病料的触片，用萋—尼二氏（Zehl-Neelson）染色法染色，光学显微镜观察。

1.2.3 细菌DNA的提取 取2-3个菌落的放入离心管中，加入200 μL TE缓冲液，85~90℃煮10 min后，立即-20℃冷冻15 min，加入40 μL（20 mg/mL）溶菌酶，混匀，37 ℃孵化2 h后迅速加热到65℃。再加入250μg/mL蛋白酶K和终浓度1%SDS，震荡30 min，加入终浓度为1%的 CTAB和 NaCl混合液（CTAB 10%;NaCl 0.7 M），65℃孵化 20 min。加入等体积的氯仿/异戊醇（24/1）提取，离心后取上清液，加入0.6体积的异丙醇沉淀，离心去掉上清，自然干燥，加入25μL无菌蒸馏水溶解DNA，-20℃保存备用。

1.2.4 TaqMan荧光PCR扩增体系和反应条件 TaqMan荧光定量PCR反应体系为25μL，其中ddH2O 13 μL，10×Ex PCR buffer（含 5 mM MgCl2）5μL，dNTP（2.5 mM）2μL，引物 （10 pmol/μL） 和探针（10 pmol/μL）各 0.5 μL，Ex Taq 热启动酶（5 u/μL）0.5 μL，DNA3 μL。，按下列反应参数进行：95℃预变性4 min；95 ℃变性 15 s，60 ℃退火延伸30 s，40个循环；退火延伸检测荧光信号。

2 结果

2.1 镜检结果 采集病料的触片经萋—尼二氏染色，为短杆状红色抗酸杆菌（图1）。

2.2 分离培养结果 经过碱处理的病料接种到7H10固体培养基，45 d后有一只水貂的肺脏和淋巴结样本长出菌落，将菌落转接到7H9和7H10固体培养基进行纯化培养。

2.3 荧光探针检测结果

2.3.1 结核分枝杆菌复合群检测根据致病性结核杆菌复合群特有的RD1序列区域设计引物和探针，对所分离的病原菌进行检测。以H37Rv、牛分枝杆菌为阳性质控菌株，BCG和其他分枝杆菌为阴性质控菌株。所分离的病原出现扩增曲线，证明所分离的菌株是致病性结核杆菌（图2）。

2.3.2 牛分枝杆菌检测以牛分枝杆菌为阳性质控菌株，H37Rv、草分枝杆菌、耻垢核分枝杆菌为阴性质控菌株。对分离病原进行亚种鉴定，出现阳性扩增曲线，说明所分离的水貂结核病原菌属于牛分枝杆菌亚种（图3）。

3 讨论

结核杆菌的分离培养对病料的前处理要求较高，我们处理了十只水貂的内脏样品，但只从一只水貂样本中分离得到牛分枝杆菌，原因可能是由于样品处理时间不当。不同亚种分枝杆菌对培养基敏感性存在差异，通常使用的L-J培养基对于牛分枝杆菌的检出率比较低[7]，所以本研究使用7H10培养基添加OADC增菌剂进行初代分离培养，菌落较L-J培养基小，但是菌落在整个培养基斜面分布更加均匀，菌落数量增多，有利于进一步纯化培养。

结核杆菌的常规检测方法为生化鉴定等，属于表型分类法，是以形态和理化特征为依据，近年来变异株的出现，导致了生化检测的特异性降低，让MTC物种级鉴定依然存在较大难度[8-9]。分子生物学技术应用在疾病的诊断逐渐被人们所认可，特别是对于体外培养困难的病原微生物的诊断具有重要的作用[10-11]。结核杆菌复合群荧光PCR检测研究较多主要是IS6110插入序列，该序列在部分牛分枝杆菌中只存在单一拷贝[12]，这就导致以IS6110片段为模板动物结核病病原检测时存在弊端。本研究应用的结核杆菌RD1序列只存在于结核杆菌复合群致病株中，基于该位点的荧光PCR检测技术可以增加检测的特异性，能够将致病性结核杆菌与BCG以及其他非致病性结核杆菌区别，根据牛分枝杆菌基因组中特有的229 bp序列设计引物与探针可以对结核杆菌复合群直接进行亚种鉴定，有利于结核杆菌的快速检测，缩短动物检验检疫时间，促进动物结核病的防治。

[1]张伟.关于中国的毛皮动物养殖业[J].野生动物养殖.2004（1）：16-17.

[2]Smith G C．Model of Mycobacterium bovis in wildlife and cattle[J]．Tuberculosis，2001，81（1）：51-64.

[3]Chen J H，Su X D，Zhang Y，et a1.Novel recombinant RD2-and RD11-encoded Mycobacterium tuberculosis antigens are potential candidates for diagnosis of tuberculosis infections in BCG-vaccinated individuals[J].Microbes Infect，2009，11（10-11）：876-885.

[4]Heid C A，Stevens J，Livak K J，et al.Real time quantitative PCR [J].Genome Res，1996，6（10）：986-994.

[5]Fend R，Geddes R，Lesellier S.Use of an electronic nose to diagnose Mycobacterium bovis infection in badgers and cattle[J].JClin Microbiol，2005，43（4）：1745-1751.

[6]Pas SD，Fries E，De Man R A，et al.Development of a quantitative real-time detection assay for hepatitis B virus DNA and comparison with two commercial assays[J].JClin Microbiol，2000，38（8）：2897-2901.

[7]Moda G，Daborm C J，et al.The zoonotic importance of Mycobacterium bovis[J].Tuber Lung Dis，1996，7 （7）：103-108.

[8]Grange J M，Yates M D，de Kantor I.Guidelines for Speciation Within the M.tuberculosis Complex[Z].2ed.World Health Organization，Geneva，unpublished docu-ment.1996.WHO/EC/Zoo/96.4.

[9]Niemann S，Harmsen D，Rusch Gerdes S，et al.Differentiation of clinical M.tuberculosis complex isolates by gyrB DNA sequence polymorphism analysis[J].J Clin Microbiol.2000，38（9）：3231-3234.

[10]Perkins M D.New diagnosis tools for tuberculosis[J].Int J Tuberc Lung Dis，2000，4（12 Suppl 2）：182-188.

[11]Nooedhoek G T，Van Embden J D，Kolk A H.Reliability of nucleic acid amplification for detection of Mycobacterium tuberculosis：an international collaborative quality control study among 30 laboratories[J].J Clin Microbiol ，1996 ，34（10）：2544-2525.

[12]Savelkoul PH M，Catsburg A，Mulder S，et al.Detection of Mycobacterium tuberculosis complex with Real Time PCR：Comparison of different primer-probe sets based on the IS6110 element[J].JMicrobiol Methods，2006，66（1）：177-180.