新型八核铜配合物乳剂对小鼠H22腹水瘤的抑制作用

葛蓓蕾,陈小让,徐 霞,张丽蓉

(郑州大学 1.基础医学院,2.实验动物中心,3.药学院,河南 郑州 450052)

恶性肿瘤是危害人类健康的严重疾病之一。随着对肿瘤形成机制研究的深入,化疗在肿瘤的治疗中日益重要。由于传统的抗肿瘤药价格昂贵,且对机体均有明显的毒副作用,因此,研究开发廉价、低毒的抗肿瘤药物已经成为了当前所面临的迫切问题[1]。本实验所用新型八核铜配合物乳剂(Nanoporous Octanuclear Cu(Ⅱ),N-Cu)是由本校化学系无机教研室合成的新型铜配合物的纳米材料,具有特殊的双螺旋结构[2]。它是以抗高血压药替米沙坦为配体,和8个铜整合在一起的相对分子质量为8 723的大分子化合物。

在进行了急性毒性研究的基础上,本文用H22模型小鼠对N-Cu的体内抗肿瘤作用进行了研究,目的在于探讨将其开发成为廉价、低毒的抗肿瘤药物的可能性。

1 材 料

SPF级昆明种小鼠 90只,体重(20.0±2.0)g,雌性,河南省实验动物中心提供。动物生产合格证号:SCXK(豫)2005-0001。普通环境条件下进行该试验,温度 20～22℃,相对湿度 45%～50%,自由采食和饮水。

顺铂注射液(2mL∶10mg),江苏豪森药业有限公司,批号:20081208;N-Cu,本校无机教研室合成。

CJ-2F型医用洁净工作台,苏州市冯氏实验动物设备有限公司;BH-2型倒置显微镜,日本 Olympus公司。

小鼠 H22腹水瘤,引自中国科学院上海细胞生物研究所,在郑州大学药学院传代保存。

2 方 法

2.1 建立稳定的H22小鼠腹水瘤模型

按常规方法,选择接种 H22后5～7d的健康小鼠,无菌条件下抽吸腹水,用生理盐水1∶1稀释后,显微镜下计活细胞数,调整其浓度至1×107个/mL[3],消毒小鼠的腹部皮肤,用无菌注射器将 H22腹水瘤细胞悬液0.5mL,注入小鼠腹腔。以后每5～7d小鼠体内传代 1次,形成稳定的传代体系。大约传 3～5代即可进行试验。

2.2 接种

记录每只实验小鼠的体重后,用75%乙醇和碘酒腹部消毒,每只小鼠腹腔注入H22腹水瘤细胞悬液(含腹水瘤细胞5×106个)0.5mL。

2.3 分组及给药

接种次日,随机将小鼠分成生理盐水阴性对照组、空白乳剂对照组、顺铂阳性对照组(1.0mg/kg)、低剂量 N-Cu组(0.2mg/mL)、中剂量 N-Cu组(0.4mg/mL)和高剂量 N-Cu组(0.8mg/mL)。每组15只动物。接种 24 h后开始给药。尾静脉注射0.2mL/10 g给药治疗,1次 /d,连续 7d。

2.4 检测指标

称重荷瘤小鼠在第1,3,5,7天的体重及第1,4,7天的平均采食量,测量荷瘤小鼠在第1,4,7天的腹围。第7天给药后24 h,每组处死 5只小鼠,抽取全部腹水,测量腹水体积。取心、肝、脾、肺、肾,肉眼观察并做病理切片。剩余小鼠观察生存时间,并计算生命延长率。

2.5 统计学处理

应用SPSS 13.0 for windows统计软件进行统计分析,组间样本均数比较采用单因素方差分析。数据以(±s)表示。

3 结 果

3.1 一般情况观察

6组小鼠在给药期间及观察期内未见毛色发暗、脱毛等;未见惊厥,抽搐。呼吸平稳,无异常鼻腔分泌物。便质中,量中,无呕吐。尿色、尿量正常[4]。给药 48 h后,N-Cu高、中剂量组出现自主活动减少、静卧不动,被毛紊乱。顺铂组给药后出现兴奋,消瘦等症状。顺铂组第4天死亡 1只,第6天死亡 2只,N-Cu中、低剂量组第6天各死亡 1只,第8天每组处死 5只动物并解剖,肉眼观察心、肝、脾、肺、肾等主要脏器,N-Cu高、中剂量组发现有肿胀等异常改变,与空白对照组比较差异显著。

3.2 N-Cu对荷瘤小鼠体重的影响

结果见表1。第4天开始生理盐水组小鼠出现食欲不振的现象,体重下降明显;N-Cu高、中、剂量组小鼠饮食正常,体重变化平缓;顺铂组小鼠体重下降较为明显。从体重来看,N-Cu各剂量组对小鼠的生长均无明显的抑制作用。

3.3 N-Cu对荷瘤小鼠腹围及腹水量的影响

结果见表2。给药后第4天,生理盐水对照组、空白乳剂对照组、顺铂组与N-Cu高、中、低剂量组相比出现腹围增加;给药后第7天,生理盐水对照组、空白乳剂对照组与N-Cu高、中、低组相比,腹围明显增加,且小鼠出现反应迟钝,行动迟缓。顺铂组与N-Cu高、中、低组比较腹围没有明显差异,但小鼠被毛紊乱,精神状态相比较差。停药次日立即解剖收集腹水定量。N-Cu中、低剂量组与生理盐水组比较差异有统计学意义,N-Cu高剂量组与其它 3组比较均有明显差异(P＜0.05)。

3.4 N-Cu对荷瘤小鼠平均采食量的影响

分别测定6组动物的平均采食量,称重各组给药后第1,4,7天的饲料量。结果见表3。

3.5 N-Cu对荷瘤小鼠生存期的影响

停药次日即第8天将每组的15只小鼠随机取出 9只正常饲养观察并记录小鼠的死亡时间,计算存活天数(存活超过 30 d的按 30 d计算)及生命延长率。生命延续率试验重复 3份。

表1 N-Cu对荷瘤小鼠体重的影响(n=15,±s)Tab.1 N-Cu of the body weight of tumor-bearing mice(n=15,±s)

表1 N-Cu对荷瘤小鼠体重的影响(n=15,±s)Tab.1 N-Cu of the body weight of tumor-bearing mice(n=15,±s)

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表2 N-Cu对荷瘤小鼠腹围和腹水量的影响(n=15, ±s)Tab.2 N-Cu of the abdomen and the amount of ascites of tumor-bearingmice(n=15, ±s)

表2 N-Cu对荷瘤小鼠腹围和腹水量的影响(n=15, ±s)Tab.2 N-Cu of the abdomen and the amount of ascites of tumor-bearingmice(n=15, ±s)

与生理盐水组比较:1P＜0.05Compared with the saline group:1P＜0.05

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表3 N-Cu对荷瘤小鼠平均采食量的影响(n=15)Tab.3 N-Cu of the average intake of tumor-bearing mice(n=15)

生命延长率(%)=(治疗组的平均存活天数/对照组的平均存活天数 -1)×100%。

结果见表4。各用药组较对照组生存时间明显延长(P＜0.05),生命延长率在12%～62%之间。对照组接种后第11天开始出现死亡,至20 d时,对照组全部死亡,低剂量组有 0只生存(12.1%),中剂量有 2只生存(36.3%),高剂量组有 2只生存(61.5%)。

3.6 病理组织学观察

停药次日即第8天将每组小鼠随机取出 5只,解剖取出小鼠的心、肝、脾、肺、肾,称重,HE染色。用中性福尔马林液固定,乙醇脱水、二甲苯透明,石蜡包埋、切片,显微镜下观察组织切片。心、脾、肺、肾未见明显病理变化。肝脏病理切片结果见图1。

表4 N-Cu对荷瘤小鼠生命延长率的影响(n=9,±s)Tab.4 N-Cu of the life span of tumor-bearingmice(n=9,±s)

表4 N-Cu对荷瘤小鼠生命延长率的影响(n=9,±s)Tab.4 N-Cu of the life span of tumor-bearingmice(n=9,±s)

与生理盐水组相比:1P＜0.05Compared with the saline group:1 P＜0.05

组别 平均存活时间/d 生命延长率/%生理盐水组 15.2±4.4 -乳剂对照组 15.6±4.0 -低剂量组 17.0±3.01 12.1中剂量组 20.7±4.71 36.3高剂量组 24.5±4.41 61.5

图1 H22小鼠的肝病理切片(×400)Fig.1 Slice of liver in H22 mice(×400)

生理盐水对照组肝组织切片中可见结节性病变的部位,其肝细胞疏松,肿胀,肝窦扩张,见癌细胞浸润,癌细胞异型性明显,细胞核大深染,核仁明显。用药后,高、中剂量组可见肝细胞肿胀,核仁明显,染色质丰富,未见明显异型细胞。

4 讨 论

在对腹水瘤 H22小鼠体重的影响上,各剂量组与溶剂对照组相比小鼠体重变化无明显差异;与生理盐水组相比,顺铂对照组小鼠体重下降明显。可见 N-Cu各剂量组对小鼠的生长无明显的抑制作用,也不因剂量的增加出现体重抑制现象。

在对腹水瘤 H22小鼠腹围的影响上,第4天开始生理盐水对照组、空白乳剂对照组、顺铂组与NCu高、中、低剂量组相比出现腹围增加;第7天生理盐水对照组、空白乳剂对照组与N-Cu高、中、低组相比,腹围明显增加,且小鼠出现反应迟钝,行动迟缓。顺铂组与N-Cu高、中、低剂量组比较腹围没有明显差异,但小鼠被毛紊乱,精神状态相比较差。

由腹水体积得知,高、中、低剂量组腹水体积与生理盐水组相比都具有统计学差异(P＜0.05),说明该 N-Cu对腹水的生成具有抑制作用。

从生命延长率来看,30 d后对照组全部死亡,高、中、低剂量组生命延长率分别为61.5%,36.3%,12.1%。各用药组与生理盐水组相比生命延长率均有统计学差异(P＜0.05)。高剂量的N-Cu能明显延长生存时间,但生命延长率较顺铂略小。

病理组织切片形态观察比较可见,用药后,高、中剂量组可见肝细胞肿胀,核仁明显,染色质丰富,未见明显异型细胞。

本实验结果表明,N-Cu具有抗肿瘤作用,明显改善肝脏环境,生命延长率有明显的延长,但高剂量对肝脏和心脏有较明显的抑制作用,低剂量的N-Cu也具有明显的毒性作用。综上可知,该新型八核铜配合物乳剂具有抗肿瘤活性,但有一定的毒性。目前我们正做进一步研究,以增强 N-Cu作用的靶向性,减小其对肝脏和心脏的毒副作用。该药物仍处于前期的研究阶段,有必要扩大样本数及增加荷瘤鼠的种类进一步研究其抑瘤作用。此外,关于N-Cu毒副作用及抗肿瘤作用机制仍有待进一步研究。

[1]张寿春.新型含铂、铜络合物抗肿瘤活性与DNA切割活性研究[D].南京:南京大学博士学位论文,2004.

[2]齐晓宇.新型金属铜络合物的抗肿瘤作用及机制研究[D].郑州:郑州大学硕士学位论文,2009.

[3]徐淑云,卞如濂,陈修.药理实验方法学[M].3版.北京:人民卫生出版社,2001:1761-1762.

[4]王国平,雷群芳.双核铜(Ⅱ)-氟喹诺酮-邻菲咯啉混配络合物的合成、晶体结构和抗肿瘤活性[J].无机化学学报,2003,19(9):1001-1004.