夏枯草提取物对Caco-2细胞α-葡萄糖苷酶、SGLT-1、GLUT-2、Na+-K+-ATP酶mRNA表达的影响

吴慧平,哈团柱,郜 明

(1.南京中医药大学 基础医学院,江苏 南京 210029;2.美国东田纳西洲洲立大学,Johnson City,TN 37614,USA)

2型糖尿病的发生,与葡萄糖耐量缺损相关。由于β细胞第一相分泌障碍,使葡萄糖耐量下降,葡萄糖耐量缺损临床上表现为餐后高血糖[1]。餐后高血糖是大血管疾病的独立危险因素,与视网膜病变、颈动脉内膜中层增厚、心肌血容量和血流量下降、癌症风险增高有关[2]。干预葡萄糖耐量缺损有效措施,即控制餐后高血糖,可以使高危患者中 1/3的人血糖恢复正常;1/3的人避免转化为糖尿病。因此,降低餐后高血糖,对2型糖尿病的发生和发展,以及大血管疾病的预防具有非常重要的意义。

降低餐后血糖水平,涉及到碳水化合物消化与吸收过程中的α-糖苷酶类、载体,如单糖在吸收环节上钠葡萄糖共转运载体 1(sodium glucose cotransporters 1,SGLT1)和葡萄糖协助扩散转运载体 2(facilitative glucose transporters 2,GLUT2)、Na+-K+-ATP酶、胃肠激素刺激胰岛素早期分泌等因素,其中任何环节被阻断都能延缓单糖吸收和降低餐后血糖水平。

我们以往的研究提示,夏枯草提取物可能通过抑制α-淀粉酶、α-麦芽糖酶活性,而提高正常和四氧嘧啶糖尿病模型 ICR小鼠的淀粉耐量,以及提高正常 ICR小鼠的麦芽糖耐量,降低餐后高血糖[3-6]。为了探讨夏枯草提取物对碳水化合物水解和葡萄糖吸收影响的作用机制,本研究以Caco-2细胞为研究对象,采用药物干预的方式,观察了夏枯草提取物对Caco-2细胞的α-葡萄糖苷酶 mRNA水平和影响葡萄糖转运的主要载体 SGLT-1、GLUT-2及Na+-K+-ATP酶的mRNA水平表达情况。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

夏枯草(Prunella vulgaris L.)为唇形科植物夏枯草的干燥果穗,2008年夏产于江苏省句容县,由南京中医药大学中药学院陈建伟教授鉴定。

阿卡波糖片(拜糖平),50mg/片,Bayer公司;Trizol RNA抽提试剂 (No.15596-018)、GeneAmp Gold RNA PCR core试剂 (No.4308267)、GeneAmp RNA control试剂(No.4308238),invitrogen公司;100 bp DNA ladder(No.27762603)promega公司 ;引物均由XXIDTⓇ公司合成:SGLT-1(上游 5′-CTCTTCACCATGGACATCTAC-3′;下游 5′-GATAATCGTGGGACAGTTGCT-3′);GLUT-2(上游 5′-CACTGATGCTGCATGTGGC-3′;下游 5′-ATGTGAACAGGGTAAAGGCC-3′);Na+-K+-ATP酶 (上游5′-TGGATAACTCCTCGCTCACT-3′;下游 5′-ATTGGCTACGATGATACCG-3′);α-葡萄糖苷酶(上游 5′-AAGCAGAGCCTGTGTGCGGG-3′;下游 5′-CACAGAGCAGCCCTCCAGGC-3′);甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)(上游 5′-CTCCATCCTGGCCTCGCTGT-3′;下游 5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′)。

1.2 仪器

Isotempx细胞培养箱;MP-STTMPhotographic成像系统;PTC-100TMprogrammable Thermal Controller PCR仪;E-CMidicellTMEC350电泳系统。

1.3 Caco-2细胞

Caco-2细胞,ATCC公司;DMEM培养基 +10%FBS,10mg氨苄青霉素,10mg链霉素,1%非必需氨基酸(NEAA),均购自 Gibco公司。

1.4 夏枯草提取物的制备

1.4.1 夏枯草水提物的制备 干燥夏枯草称重后,漂洗、剪碎、冷水浸泡后,直火加热煎煮,过滤,重复煎煮 2次,药液合并,冷却后离心,隔水浓缩后,冷冻干燥,得率为14.86%,用ddH2O溶解药物储备,细胞实验前过滤药物,用培养基稀释药物至实验所需浓度。

1.4.2 夏枯草浸膏和多糖的制备 在夏枯草水提物中加入一定量的95%乙醇,4℃冰箱过夜,离心,上清液浓缩为浸膏,得率为5.97%。醇沉物经无水乙醇、丙酮、乙醚分步脱水得到夏枯草灰白色粗多糖粉末,得率为8.56%,其费林试剂、碘试剂反应均为阴性,α-萘酚试剂反应呈紫红色。

1.5 夏枯草提取物的细胞毒性测定

将汇合度密度为2×105的Caco-2细胞接种于6孔板中(3个复孔),待细胞贴壁后,分别加入不同浓度的药物,即夏枯草水提物(3,1.5,0.75,0.375,0.1875μg/mL),(相当于生药 40.38,20.19,10.095,5.048,2.524μg/mL);夏枯草浸膏(1,0.5,0.25,0.125,0.0 625μg/mL)(相当于生药13.46,6.73,3.365,1.68,0.84μg/mL);夏枯草多糖(2,1,0.5,0.25,0.125μg/mL)(相当于生药 26.92,10.46,5.23,2.615,1.31μg/mL);阿卡波糖(50,25,12.5,6.25,3.125μg/mL),待药物作用24 h后,用台盼蓝进行染色检测药物对细胞的毒性作用,选择合适的药物作用浓度。

1.6 RNA提取及PCR反应

Caco-2细胞(3个复孔),以2×105的密度接种于6孔板中培养,待细胞贴壁后汇合度达 70%左右,加入药物(筛选浓度)处理24h。使用Trizol试剂常规方法提取总 RNA。并取RNA 0.8μg进行逆转录合成cDNA。随后进行 PCR反应,反应体系 25 μL。

α-葡萄糖苷酶 PCR反应条件:94℃,5 min预变性;94℃,45 s变性;60℃,45 s退火;72℃,45s延伸;循环35次;再72℃,10 min;4℃,2h。其中MgCl2浓度为2 mmol/L,扩增产物片断为292 bp。

SGLT-1、GLUT-2和Na+-K+-ATP酶 PCR反应条件:94℃,5min预变性;94℃,45 s变性;55℃,45s退火;72℃,45 s延伸;循环35次;再72℃,10 min;4℃,2h。其中mgCl2浓度为1.5mmol/L,扩增产物片断为354,525,385 bp。

RT-PCR产物经1%琼脂糖电泳,经溴乙锭染色拍照,其电泳 PCR DNA条带的密纹灰度,由Alpha-EaseFc扫描计算其灰度值。

1.7 统计学分析

2 结 果

2.1 夏枯草提取物对细胞毒性的影响

夏枯草水提物在0.75μg/mL,其浸膏和多糖分别在0.25和0.5μg/mL的浓度,阿卡波糖在25 μg/mL均未对细胞产生毒性作用。故后续 PCR试验中药物浓度均按筛选后浓度进行细胞培养。

2.2 夏枯草提取物对Caco-2细胞α-葡萄糖苷酶mRNA的表达影响

结果如图1。药物作用24 h后,与阴性对照组相比,夏枯草三种提取物对α-葡萄糖苷酶 mRNA水平表达均有一定的抑制作用(P＜0.05),其抑制作用与阳性药阿卡波糖相似。

2.3 夏枯草提取物对Caco-2细胞SGLT-1及GLUT-2mRNA的表达影响

结果如图2。药物作用24h后,与阴性对照组比较,夏枯草三种提取物对SGLT-1的mRNA表达均有一定的抑制作用(P＜0.05),其中夏枯草水提物的作用更为明显(P＜0.01);对GLUT-2mRNA表达均呈极显著差异(P＜0.01)。

图1 夏枯草提取物对Caco-2细胞α-葡萄糖苷酶 mRNA的表达影响(n=3,±s)Fig.1 Effects of the Prunella vulgaris L.extract on expressions ofα-glucosidase mRNA in Caco-2cells(n=3,±s)

2.4 夏枯草提取物对Caco-2细胞Na+-K+-ATP酶mRNA的表达影响

图2 夏枯草提取物对Caco-2细胞对SGLT-1mRNA(A)和GLUT-2mRNA(B)的表达影响(n=3,±s)Fig.2 Effects of the Prunella vulgaris L.extract on expressions of SGLT-1mRNA(A)and GLUT-2 mRNA(B)in Caco-2 cells(n=3,±s)

如图3所示,药物作用24 h后,与阴性对照组相比,夏枯草三种提取物对Na+-K+-ATP酶的mRNA水平表达均有一定的抑制作用(P＜0.05),而夏枯草水提物的作用更为显著(P＜0.01)。

图3 夏枯草提取物对Caco-2细胞Na+-K+-ATP酶 mRNA的表达影响(n=3,±s)Fig.3 Effects of the Prunella vulgaris L.extract on expressions of Na+-K+-ATPase mRNA in Caco-2 cells(n=3,±s)

3 讨 论

机体对碳水化合物消化过程由α-糖苷酶类参与,其活性和含量是碳水化合物水解成为葡萄糖的关键步骤。葡萄糖吸收的整个过程由2个家族的跨膜转运载体蛋白——SGLT1和GLUT2参与[6-7]。而起主导作用的是位于小肠细胞黏膜表面上的SGLT1,该蛋白在其基底膜细胞Na+-K+-ATP酶作用下逆 Na+浓度差,通过消耗能量,主动转运葡萄糖[8-9]。可见 SGLT1载体数量,是葡萄糖吸收的决定因素。GLUT2位于基底膜以易化扩散方式顺葡萄糖的浓度梯度,把肠黏膜细胞内聚集葡萄糖协助转运到组织间隙液,进而葡萄糖进入血液,其转运过程不消耗能量[10]。如此,肠道葡萄糖的跨膜吸收主要涉及SGLT1、GLUT2及Na+-K+-ATP酶 3个蛋白[11]。

经过夏枯草提取物对Caco-2细胞的α-葡萄糖苷酶,SGLT1、GLUT2、Na+-K+-ATP酶在mRNA水平的研究,我们观察到夏枯草提取物能明显降低 α-葡萄糖苷酶,SGLT1、GLUT2、Na+-K+-ATP酶的mRNA表达,综合前期研究表明,夏枯草提取物能降低正常和四氧嘧啶糖尿病模型 ICR小鼠餐后血糖水平,不仅涉及直接抑制α-糖苷酶活性,而且在长期时间给药条件下,可能抑制参与葡萄糖吸收的这些靶点基因的表达。

阿卡波糖属α-葡萄糖苷酶抑制剂,但其对α-葡萄糖苷酶和SGLT1、GLUT2、Na+-K+-ATP酶基因表达影响如何,尚未见文献报道。本实验中阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶和SGLT1、GLUT2、Na+-K+-ATP酶mRNA表达存在抑制作用为新发现,还有待在多次给药的整体动物实验中进一步证实。

夏枯草提取物有类似于阿卡波糖的α-葡萄糖苷酶抑制剂作用[3-4]以及对 α-葡萄糖苷酶和SGLT1、GLUT2、Na+-K+-ATP酶 mRNA表达也有同样的发现,提示夏枯草提取物对干预葡萄糖耐量缺损和肥胖症均有一致意义。也表明其可能会出现类似于阿卡波糖的胃肠道反应。夏枯草提取物抑制单糖吸收相关基因表达作用的发现,将为其干预葡萄糖耐量缺损的进一步研究提供了更多依据。

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