发展毒性测试新策略和基于毒作用模式的健康危险评定

周宗灿

(北京大学医学部毒理学系，北京 100191)

化学品安全已成为国际和我国社会经济发展的重大问题，化学品安全是食品安全、环境安全和职业安全的基础。化学品不仅可引起对人体健康的有害作用和中毒，还是多种常见病、多发病的重要危险因素。对化学品的管理应基于循证毒理学和健康危险评定。目前化学物毒性测试已成为化学品健康危险评定和管理的瓶颈，急需突破。主要的问题是:(1)以实验动物体内实验为主的化学物毒性测试标准实验体系，对一种化学品的毒性测试需要耗费2～3年和数百万美元。国际市场上现已存在10万种以上的化学物。年产量大于1吨化学品约有3万种需要进行毒性测试，其中仅有相当少数化学品有足够资料能够较好表征其对人或生态系统的毒性以支持管理决策。现行的标准测试方案显然不能满足要求。(2)现代分子生物学技术、组学技术和高通量筛选试验、系统毒理学的发展，在化学品毒性测试和健康危险评定没有得到充分的应用。(3)鉴于3Rs即替代、优化、减少(replacement，refinement，reduction)的理念，已发展了不少替代试验，但往往是多种替代试验检测同一个终点，如急性毒性替代试验有5种，眼刺激替代试验有6种，皮肤刺激替代试验有5种等。这样针对已有的20多种基本试验，可能会发展出百余种替代试验。替代试验的此种思路是否适当，有待探讨。

为推动化学品管理，联合国、经济合作和发展组织(OECD)、美国和欧共体都做了大量工作，如联合国实行的“全球化学品统一分类和标签制度”和欧共体提出的化学品注册、评估、授权和限制制度(registration，evaluation，anthoristation and ristriction of chemicals，REACH)法规。我国在化学品管理上还存在差距，需要我国有关毒理学研究的技术支持。

本文从三方面综述化学品毒性测试和危险评定的目前发展趋势和我们的意见。总的来说是改变毒性测试策略，以毒作用靶器官/作用模式为主线进行化学物的分类并建立相关数据库，改进危险评定方法［1］。

1 毒性测试策略的转变

2007年美国国家研究委员会(National Research Council，NRC)应美国环保局(EPA)和国家毒理学计划(National Toxicology Program，NTP)的要求，为毒性测试发展长期展望和关于实现展望的策略计划发表了一份题为《21世纪的毒性测试:展望和策略》的研究报告。报告指出毒性测试策略转变需要实现如下目标:① 实现对化学品、化学混合物、不同结局和生命阶段的广泛覆盖;② 减少毒性测试所需的费用和时间;③发展用于评定环境因子健康效应的更为可靠的科学基础;④将测试中动物的使用数量降到最低。报告重点提出了毒性测试和危险性分析的总体框架(图1)，包括化学表征、毒性测试(毒性途径和靶向测试)、剂量-反应和外推建模、人群和暴露资料、危险分析。毒性测试方案的核心是人源性细胞的体外毒性-途径测试(toxicity-pathway testing)和整体动物染毒的靶向测试(targeted testing)。在体外培养人源性细胞中经化学毒物处理确定细胞应激至死亡的信号转导途径是此策略第一关键步骤，细胞应激至死亡通常有多种信号转导途径。NRC报告中提出了一些毒性途径例子，如核因子红细胞衍生2(E2)样因子〔nuclear factor(erythroid-derived 2)-like 2，Nrf2〕抗氧化反应途径、热休克反应途径、孕烷X受体(pregnane X receptor，PXR)反应途径，组成型雄烷受体(constitutive androstane receptor，CAR)反应途径，过氧化物酶增殖体激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)反应途径、芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor，AhR)反应途径、低渗透压反应途径、DNA损伤反应途径和内源性激素反应途径等。此外，也有提出内质网应激途径、炎症反应途径、缺氧以及金属应激途径等［2］。在确定了毒作用途径后，应进行14 d重复染毒体内毒性试验，确定毒作用的靶器官，必要时进行代谢产物评价和在转录组学水平研究受影响的细胞过程。

图1 NRC(2007)提出的毒性测试和危险性分析总体框架.

该报告提出后，在毒理学界引起了强烈反响，Collins等［3］提出，毒性评定从动物体内研究转移到体外实验，低等生物体内实验和计算机建模。并且美国的NTP、EPA和国立卫生研究院化学基因组学中心(NIH Chemical Genomics Center，NCGC)对此开展了协作研究［4］。NRC方案是试验策略的转变，而不是试验方法的替代，此策略可减少试验的经费和时间，与现代机制毒理学和系统毒理学的进展相结合。需要指出的是，尽管该报告提出了毒性测试和危险性分析的框架，但对于如何实施毒性测试的转变并未提出具体的和可行的指南，具有很大的发展空间。

Toxicological Sciences杂志在2009年以论坛的形式发表了十余篇论文［5］，肯定了此毒性测试新策略，但也提出了一些有待深入解决的问题，如不同靶器官细胞的毒性途径的特异性，有害效应和适应的分界点，毒性途径网络中各毒性途径对毒性结局的相对贡献，靶器官细胞间的交互作用，以及如何预测整体动物实验长期染毒观察到的最低作用剂量和未观察到的有害作用剂量等。这些问题均有待于进一步研究和解决。

2 基于靶器官/毒作用模式的化学物分类

减少毒性测试工作量的另一个方法是将密切相关的化学品作为一组或一类，全面测试一个类别中的参照化学物，对其他化学物只需要测试其毒效应或关键事件的相对强度。OECD(2007)已提出了化学品分类初步指南［6］。以被测试的化学物和终点的数据可用于估计未经测试的化学物的性质和终点，填补缺失数据的方法，包括类似物法(category approach)、交叉取值 (read-across)，定量结构-活性关系(quantitative structure-activity relationship，QSAR)、外推和内插等。

近年来，在机制毒理学研究中发展了毒作用模式(mode-of-action，MOA)的概念，毒作用模式是指证据权重支持的可能导致毒性有关终点的一组关键事件。关键事件是引起毒理学反应MOA所关键的和可测量的事件。毒作用机制是指从分子水平到肉眼可见的毒性或组织病理学毒性、各事件的精确途径的详细描述。显然利用MOA的概念可简化对化学物毒作用机制的表征，有助于在易感人群和生命阶段的外推。并且，结构相似的化合物可能具有相类似的毒作用模式，建议应该根据化学结构和毒性(靶器官/毒作用模式)进行分类，即化学物结构-毒性(structure-toxicity，ST)分类方法。化学物的化学结构是决定毒性的物质基础，决定其理化性质和化学活性，分别影响化学物在体内的毒动学和毒效学过程。化学物理性质可预测其毒动学特征。在毒效学方面，化学物引起细胞的生物分子损伤，进而引起细胞应激。因为细胞监测大分子损害而不是造成这些损伤的化学物类型，所以，细胞的应激反应具有生物分子损伤特异性，并不是化学物特异性的。而靶器官毒性则显示与该器官结构和功能相关联的特点。因此，化学物结构决定其毒动学特点和其在靶器官中与生物分子的反应性，而在靶器官的毒作用模式和靶器官毒效应则取决于细胞应激的类型和该器官结构和功能特点。例如，肝毒物有1000种以上，肝细胞毒性机制有6种，肝临床病理综合征有15种。不同的毒物可通过共同的途径引起靶细胞损伤和死亡，进而导致靶器官毒效应。化学物ST分类即是以化学结构为基础，化学物的理化性质可预测其毒动学特征，以靶器官/毒作用模式表征毒效学特征。此ST分类法将具有毒理学特色和实用性。

3 基于毒作用模式的危险评定

健康危险评定方法学上已有相当大的发展，已发展了许多新的方法来改进危险度评定中的剂量-反应关系的评定，如基准剂量(benchmark dose，BMD)法、概率危险评定、分类回归法、化学物特异性调整因子(chemical-specific adjustment factors，CSAF)法、基于生理学的毒代动力学(physiologically based toxicokinetics，PBTK)法等。这些新的方法学主要侧重于如何较好地确定危险度评定起始点值，考虑易感亚人群，降低危险度评定的不确定性等。侧重点主要是优化外推起始点(如BMD)和发展CSAF法。CSAF法以化学物特异性的毒动学和毒效学资料作为依据来代替由于物种间差异和个体差异外推的默认值［7－8］。CSAF法优点是概念明确并可作为良好的方法学平台，在此基础上可以包含和发展上述各项研究需要和更深层次的改进。而且，国际化学品安全性规划署(IPCS)发展了的癌和非癌终点MOA的人类关联性框架(human relevance framework，HRF)［9－10］，以关键事件/毒作用模式的相似性来判断动物资料外推到人的可靠性。我们提出，以相同毒作用机制/模式的肝毒物在关键事件的差异建立毒效学CSAF，比对全部毒物逐个确定毒效学CSAF在工作量和准确性上可有较大的改进。以MOA对于CSAF法的改进，需要:①研究靶器官毒效应的各种毒作用模式和关键事件，确定其限速性关键事件，以及检测指标(生物学标志);②发展以化学物结构和(或)作用模式ST分类及相关数据库，发展各ST分类化学物的各系数的预测和确定方法;③发展CSAF法的各系数和从小样本资料外推总体反应的概率描述和不确定性。上述化学物分类法和靶器官毒作用模式研究，可能发展化学物类别/靶器官的CSAF法，外推并评定危险度，减少工作量。

目前毒理学的发展正处于十字路口，需要发展转化毒理学(translational toxicology)［11］，以迅速地在基础研究与危险管理之间建立更直接的联系。

［1］周宗灿，李 涛.基因与环境的交互作用:健康危险评定与预警［M］.上海:上海科学技术出版社，2009:11-30，92-100，103-128，385-424.

［2］Simmons SO，Fan CY，Ramabhadran R.Cellular stress response pathway system as a sentinel ensemble in toxicological screening［J］.Toxicol Sci，2009，111(2):202-225.

［3］Collins FS，Gray GM，Bucher JR.Toxicology.Transforming environmental health protection［J］.Science，2008，319(5865):906-907.

［4］Schmidt CW.TOX 21:new dimensions of toxicity testing［J］.Environ Health Perspect，2009，117(8):A348-A353.

［5］Holsapple MP，Afshari CA，Lehman-McKeeman LD.Forum Series:the"Vision"for Toxicity Testing in the21st Century:prom-ises and conundrums［J］.Toxicol Sci，2009，107(2):307-308.

［6］OECD. Guidance on Grouping of Chemicals.OECD Environment，Health and Safety Publications.Series on Testing and Assessment.No 80，2007.

［7］IPCS.Guidance Document for the Use of Data in Development of Chemical-Specific Adjustment Factors(CSAFs)for Interspecies Differences and Human Variability in Dose/Concentration-Response Assessment.2001.

［8］IPCS. Chemical-Specific Adjustment Factors for Interspesies Differences and Human Variability:Guidance Document for Use of Data in Dose/Concentration-Response Assessment.2005.

［9］Boobis AR，Cohen SM，Dellarco V，McGregor D，Meek ME，Vickers C，et al.IPCSframework for analyzing the relevance of a cancer mode of action for humans［J］.Crit Rev Toxicol，2006，36(10):781-792.

［10］Boobis AR，Doe JE，Heinrich-Hirsch B，Meek ME，Munn S，Ruchirawat M，et al.IPCSframework for analyzing the relevance of a noncancer mode of action for humans［J］.Crit Rev Toxicol，2008，38(2):87-96.

［11］Mattes WB，Walker EG.Translational toxicology and the work of the predictive safety testing consortium［J］.Clin Pharmacol Ther，2009，85(3):327-330.