纳米银对HL-7702肝细胞DNA的损伤作用

刘鹏鹏，关荣发，伍义行，戴贤君，黄光荣

(中国计量学院生命科学学院，浙江杭州 310018)

银是一种安全广谱的抗菌材料。银被纳米化后，其抗菌作用产生了质的飞跃，极少量的纳米银即可产生强力的杀菌作用［1］。纳米银展现出的优良抗菌性能，使纳米银在抗菌食品包装中的应用成为近年来研究的热点［2－3］。但是，包装材料载带的纳米银很容易通过消化道进入体内并可能在深部蓄积，目前已有报道显示纳米银可以在体内迁移［4－6］。一些体外实验显示，纳米银有一定的细胞毒性［7－9］。但是，很少有纳米银遗传毒性的报道［10］。

肝脏是纳米银在生物体内的主要靶器官，纳米银可在肝脏中大量富集。Ahamed等［11］研究发现，纳米银可引起小鼠胚胎干细胞和小鼠胚胎成纤维细胞DNA的损伤。目前，尚未发现纳米银对人肝细胞DNA损伤效应的相关报道。

本研究采用单细胞凝胶电泳技术(彗星实验)研究纳米银对HL-7702肝细胞DNA的损伤效应，以期为深入了解纳米银的毒性及其机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和仪器

纳米银和微米银购自秦皇岛市太极环纳米制品有限公司。二甲亚砜(DMSO)购于 Sigma公司;RPMI 1640，磷酸盐缓冲液(PBS)，青霉素-链霉素，L-谷氨酰胺购自Gibco公司;0.25%胰酶(trypsin)购自Hyclone公司;胎牛血清(FBS)，小牛血清(NBS)购自杭州四季青;低熔点琼脂糖购自Promega公司;Triton X-100购自Amresco公司;十二烷基肌氨酸钠、正常熔点琼脂糖、溴化乙锭(EB)、依地酸乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)和氢氧化钠(NaOH)均为国产分析纯试剂。

JSM-5610LV扫描电镜(日本JEOL公司);P/N 190653二氧化碳恒温培养箱(美国Thermo公司);DMI4000B倒置荧光显微镜(德国 Leica公司);Eppendorf-5415R低温冷冻离心机(德国Eppendorf公司);PowerPac Basic电泳仪(美国 Bio-Rad公司)等。

1.2 细胞株

人正常肝细胞HL-7702购自中国科学院上海细胞生物研究所，由本实验室冻存备用，经复苏后传代培养。培养条件为用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液，置37℃、含5%CO2及充分饱和湿度的培养箱内，2～3 d换培养液1次，待细胞贴壁至80%左右，用0.25%胰蛋白酶消化并传代，选对数生长期的细胞用于实验。

1.3 银粒子混悬液制备及粒径测定

称取纳米银和微米银，用PBS配成10 mg·L－1的银粒子混悬液，高压蒸汽灭菌后(121℃，15 min)，4℃贮存。通过JSM-5610LV扫描电镜确定其粒径分布，保存图像，用Smile View软件打开并进行测量确定其粒径及分布。

1.4 银粒子与HL-7702细胞接触培养

取对数生长期的细胞，消化后调整细胞密度为l×108L－1，均匀接种到24 孔板内，每孔500 μl。设纳米银组、微米银组和对照组。细胞贴壁后，吸弃原培养液，纳米银组、微米银组分别将对应银粒子悬浮液用细胞培养液稀释后加入到细胞培养板中，终浓度为10，25，50，100 和 250 mg·L－1，加入前超声混匀，每个浓度平行4份。对照组换完全培养基，继续培养。作用24 h后，吸弃培养液，0.25%胰蛋白酶消化，制备细胞悬液，调整细胞密度为1×108～1×109L－1。

1.5 单细胞凝胶电泳

参照Oliveira等［12］的方法操作，并根据具体情况稍加改动。将预热45℃的1.0%琼脂糖200μl滴到同样预热载玻片的磨砂面，迅速盖上干净的盖玻片，4℃下10 min使其凝固;待其凝固后，铺第二层质量分数为1.0%的低熔点琼脂糖和细胞悬液的混合液(体积比为3∶1)100μl;第二层凝胶固化后，铺第三层质量分数为0.8%的低熔点琼脂糖100μl。将制备好的凝胶放入冷的细胞裂解液(NaCl 2.5 mol·L－1，Na2EDTA 100 mmol·L－1，Tris 10 mmol·L－1，1%十二烷基肌氨酸钠，pH 10，用前加入1%的Triton X-100和10%的DMSO)中，4℃下裂解2 h，然后用PBS漂洗3 min，以洗去凝胶表面的盐分，再放入电泳槽中。将新鲜配制的电泳缓冲液(Na2EDTA 1 mol·L－1，NaOH 300 mmol·L－1，pH 13)倒入电泳槽，约覆盖过载玻片0.25 cm，避光碱解旋20 min。以0.7 V·cm－1电压电泳20 min。电泳完毕，取出载玻片浸入 Tris 0.4 mol·L－1缓冲液(pH 7.5)中洗 3次，每次10 min。用溴化乙锭20 mg·L－1暗处染色5 min，双蒸水洗掉表面的染料，荧光显微镜下观察并拍照。

1.6 统计学分析

对每一染毒组，随机取50个细胞进行分析，荧光显微镜下观察并拍照，用CASP彗星图像分析软件自动分析。以尾部DNA百分率和尾矩作为单一指标和复合指标对DNA损伤程度进行评价。将实验测得的指标数值输入SPSS统计分析软件，进行t检验。

2 结果

2.1 纳米银和微米银粒径测定

纳米银和微米银在扫描电镜下观察其形貌，由图1可见，颗粒团聚在一起，单个颗粒近似于球形。Smile View测量结果显示，纳米银的粒径为(37.8±6.7)nm(图 1A);微米银粒径为(985.4 ±283.5)nm，平均粒径约为1μm(图1B)。

图1 电镜扫描纳米银和微米银.A:×100 000，纳米银，(37.8±6.7)nm;B:×15 000，微米银，(985.4±283.5)nm.Fig.1 Scanning electron microscope images of silver nanoparticles and silver microparticles.

2.2 细胞彗星图像及CASP分析结果

对照组、微米银组及纳米银组肝细胞彗星图像以及经CASP彗星图像分析软件分析后的图像如图2所示，DNA被EB染成桔红色，对照组和微米银100 mg·L－1组肝细胞只有一个圆形的头部，无明显尾部或尾部很短。纳米银100 mg·L－1组肝细胞DNA呈彗星状，头部 DNA集中，亮度较强，尾部由DNA片段组成，呈彗星状，荧光强度不及头部，肝细胞产生较明显的DNA损伤。

2.3 纳米银和微米银对肝细胞DNA的损伤作用

不同浓度纳米银和微米银对HL-7702肝细胞DNA的损伤检测结果如表1所示。只有微米银250 mg·L－1可引起HL-7702肝细胞DNA的损伤。而纳米银在染毒剂量≥50 mg·L－1时，尾部DNA百分率及尾矩与微米银组差异显著(P＜0.05，P＜0.01)。与微米银相比，纳米银可明显引起HL-7702肝细胞DNA的损伤。

随着纳米银染毒剂量的增加，肝细胞尾部DNA百分率及尾矩均呈逐渐升高趋势，呈一定的剂量-效应关系。纳米银10 mg·L－1组尾部DNA百分率及尾矩与对照组无显著差异，纳米银≥25 mg·L－1组则显著升高(P ＜0.05，P ＜0.01)。纳米银致HL-7702肝细胞 DNA的损伤效应呈现一定的浓度-效应关系。

图2 单细胞凝胶电泳CASP软件分析图(EB ×400).细胞经纳米银和微米银100 mg·L－1染毒24 h后，进行单细胞电泳，溴化乙锭20 mg·L－1暗处染色5 min后，荧光显微镜下观察并拍照，用CASP软件分析彗星图像，并计算彗星头长(Lhead)、彗星尾长(Ltail)、彗星全长(Lcomet)、彗星头DNA百分含量(head DNA%)、尾部 DNA百分含量(tail DNA%)、尾矩(TM)、Olive尾矩(OTM).以尾部DNA百分率(tail DNA%)和尾矩(tail moment)作为单一指标和复合指标对DNA损伤程度进行评价.A:正常HL-7702细胞;B:微米银100 mg·L－1;C:纳米银100 mg·L －1.Fig.2 The analysis with CASP software on the figures of Single cell gel electrophoresis results(EB ×400)

表1 纳米银和微米银染毒后对HL-7702细胞的损伤作用Tab.1 Injury of silver nanoparticles and silver microparticles on HL-7702 cells

3 讨论

纳米银优异的抗菌性能使其在食品包装领域得到了广泛的应用，但纳米银的特殊效应也使其存在着潜在的危害。已有文献报道，纳米银不仅可以附着于细胞膜或细胞表面，而且还有可能透过细胞膜上的孔隙进入细胞内或细胞内的各种细胞器内，并有可能会透过核膜进入细胞核［13］。Hatchett等［14］研究结果表明，纳米银与DNA等含磷和硫的化合物有较高的亲和作用，并推测DNA可通过巯基与纳米银发生了作用。因此，有必要对纳米银与细胞内DNA的相互作用进行深入的研究。

纳米银粒径小，比表面积大，其表面原子具有极高的表面活性，很容易与其他原子结合，进而导致纳米银颗粒对细胞DNA产生损伤。Chi等［15］发现纳米银与十六烷基嘧啶结合共同导致小牛胸腺DNA的损伤。实验发现，纳米银组可引起肝细胞DNA呈彗星状，而微米银组和对照组均无明显变化。因此认为纳米银的小尺寸效应可能是其产生 DNA损伤的重要原因之一。

另外，纳米银表面的电子受体和供体活动位点能与分子氧发生作用，形成超氧离子，并通过歧化反应产生过量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)［16］。ROS使细胞或机体内的氧化压力增加，并对核苷酸进行攻击产生DNA断裂。因此，纳米颗粒引起的ROS也可能是纳米银引起肝细胞产生DNA损伤的又一重要原因。但纳米银诱导ROS是否是引起HL-7702肝细胞DNA损伤的主要影响因素还有待进一步的研究。

随着纳米银在食品包装领域的广泛应用，含纳米银的包装材料可以以不同的方式迁移到食品中从而对人体造成一定的伤害。Yang等［3］研究发现，纳米银可影响rpsL基因扩增的保真度，通过原子力学显微镜观察发现纳米银可与DNA分子结合，并认为纳米银作为一种食品包装材料具有潜在的长期毒性。本研究显示，纳米银可对人正常肝细胞HL-7702产生明显的DNA损伤效应。因此，纳米银作为一种食品包装材料，应严格控制其添加量和迁移量，并制定相应的标准。

综上所述，纳米银对人正常肝细胞HL-7702具有明显的 DNA损伤效应，损伤机制可能与纳米银的小尺寸效应和纳米银诱导ROS两个因素有关，但机制尚需进一步研究。该研究结果可为进一步研究纳米银的生物毒性提供实验依据。另外，也可为纳米银在抗菌包装领域的应用起一定的警示作用，并可为抗菌包装材料中纳米银添加限量及迁移限量标准的制定提供一定的参考。

［1］Sharma VK，Yngard RA，Lin Y.Silver nanoparticles:green synthesis and their antimicrobial activities［J］.Adv Colloid Interface Sci，2009，145(1-2):83-96.

［2］An JS，Zhang M，Wang SJ，Tang JM.Physical，chemical and microbiological changes in stored green asparagus spears as affected by coating of silver nanoparticles-PVP［J］.LWT Food Sci Technol，2008，41(6):1100-1107.

［3］Yang W，Shen C，Ji Q，An H，Wang J，Liu Q，et al.Food storage material silver nanoparticles interfere with DNA replication fidelity and bind with DNA［J］.Nanotechnology，2009，20(8):85102.

［4］Suh WH，Suslick KS，Stucky GD，Suh YH.Nanotechnology，nanotoxicology，and neuroscience［J］.Prog Neurobiol，2009，87(3):133-170.

［5］Kim YS，Kim JS，Cho HS，Rha DS，Kim JM，Park JD，et al.Twenty-eight-day oral toxicity，genotoxicity，and gender-related tissue distribution of silver nanoparticles in Sprague-Dawley rats［J］.Inhal Toxicol，2008，20(6):575-583.

［6］Hussain SM， Schlager JJ. Safety evaluation of silver nanoparticles:inhalation model for chronic exposure［J］.Toxicol Sci，2009，108(2):223-224.

［7］Arora S，Jain J，Rajwade JM，Paknikar KM.Interactions of silver nanoparticles with primary mouse fibroblasts and liver cells［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2009，236(3):310-318.

［8］Arora S，Jain J，Rajwade JM，Paknikar KM.Cellular responses induced by silver nanoparticles:in vitro studies［J］.Toxicol Lett，2008，179(2):93-100.

［9］AshaRani PV， Low Kah Mun G， Hande MP，Valiyaveettil S.Cytotoxicity and genotoxicity of silver nanoparticles in human cells［J］.ACSNano，2009，3(2):279-290.

［10］Singh N，Manshian B，Jenkins GJ，Griffiths SM，Williams PM，Maffeis TG，et al.NanoGenotoxicology:the DNA damaging potential of engineered nanomaterials［J］.Biomaterials，2009，30(23-24):3891-3914.

［11］Ahamed M，Karns M，Goodson M，Rowe J，Hussain SM，Schlager JJ，et al.DNA damage response to different surface chemistry of silver nanoparticles in mammalian cells［J］.Toxicol Appl Pharmacol，2008，233(3):404-410.

［12］Oliveira RJ，Matuo R，da Silva AF，Matiazi HJ，Mantovani MS，Ribeiro LR.Protective effect of beta-glucan extracted from Saccharomyces cerevisiae，against DNA damage and cytotoxicity in wild-type(k1)and repairdeficient(xrs5)CHOcells［J］.Toxicol In Vitro，2007，21(1):41-52.

［13］Morones JR，Elechiguerra JL，CamaCho A，Holt K，Kouri JB，Ramirez JT，et al.The bactericidal effect of silver nanoparticles［J］.Nanotechnology，2005，16(10):2346-2353.

［14］Hatchett DW， White HS. Electrochemistry of sulfur adlayers on the low-index faces of silver［J］.J Phys Chem，1996，100(23):9854-9859.

［15］Chi Z，Liu R，Zhao L，Qin P，Pan X，Sun F，et al.A new strategy to probe the genotoxicity of silver nanoparticles combined with cetylpyridine bromide［J］.Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc，2009，72(3):577-581.

［16］Hsin YH，Chen CF，Huang S，Shih TS，Lai PS，Chueh PJ.The apoptotic effect of nanosilver is mediated by a ROS-and JNK-dependent mechanism involving the mitochondrial pathway in NIH3T3 cells［J］.Toxicol Lett，2008，179(3):130-139.