盐干带鱼中乳酸菌的分离鉴定及其生物学特性研究

陈学云，侯鲁娜，丁玉庭，聂小华

（浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江杭州310014）

盐干带鱼中乳酸菌的分离鉴定及其生物学特性研究

陈学云，侯鲁娜，丁玉庭，聂小华*

（浙江工业大学生物与环境工程学院，浙江杭州310014）

研究了盐干带鱼加工过程中微生物的消长规律，并对产品中乳酸菌进行了分离鉴定和生物学特性研究。研究结果表明，盐干带鱼加工过程中细菌总数、酵母、乳酸菌、葡萄球菌和微球菌均呈现逐步增加趋势，其中乳酸菌为优势菌群。从产品中分离得到G+、H2O-2乳酸菌疑似菌株19株，经生理生化鉴定初步确定为食品乳酸菌（6株）、短乳杆菌（5株）和戊糖乳杆菌（2株），其它未能鉴定种属。食品乳杆菌、戊糖乳杆菌和短乳杆菌均表现出良好的生长性能和耐盐性，未检测到其脂肪酶活性，且仅戊糖乳杆菌表现出弱蛋白酶活性。

盐干带鱼，乳酸菌，分离鉴定，生物学特性

盐干鱼是我国传统水产品之一，一直以来以其易加工、耐贮藏、口味独特而广受青睐。目前盐干鱼的相关研究多集中于工艺改进［1］，其加工理论尚未开展研究。盐干加工包括了腌制和干燥工序，加工过程中存在着不同的微生物区系，其中部分微生物可促进产品质量的形成，如乳酸菌、葡萄球菌、微球菌、酵母等［2-3］。乳酸菌作为传统制品中重要微生物之一，是传统发酵香肠、干腌牛肉和金华火腿产品中的优势菌群［4］。研究发现，乳酸菌可发酵利用原料中的碳水化合物产生有机酸，降低pH，抑制一些腐败菌和致病菌的生长［5-7］，以及加速产品颜色和质构的形成。基于此，本论文采用传统加工方式制备盐干带鱼，对产品中乳酸菌进行分离鉴定，并研究其生长特性、蛋白酶活性和脂肪酶活性，以期探讨乳酸菌在传统水产品加工中的应用前景。

1 材料与方法

1.1 实验材料

带鱼 购于浙江杭州德胜农贸市场，每尾重400～600g；食盐 购于浙江杭州乐购超市。

1.2 实验方法

1.2.1 盐干带鱼的制备 带鱼去头去尾去内脏，切成鱼块（4cm×4cm），清洗沥干表面水分。于4℃、12%盐水中腌制2d后，带鱼鱼块置于25℃下风干6d，此时水分含量为35%～40%。

1.2.2 微生物分析 带鱼鱼块去骨，称取10.0g样品，加入90mL无菌蛋白胨溶液（0.1%）的三角瓶中，于无菌条件下匀浆后，进行梯度稀释后，然后选择2～3个适宜的稀释液，采用倾注平板计数法。细菌总数用PCA培养基，乳酸菌用MRS培养基，葡萄球菌和微球菌用MSA培养基，酵母菌用PDA培养基［8］。

1.2.3 乳酸菌的分离纯化 采用平板划线法。从MRS培养基挑取单个可疑菌落，在MRS平板上反复多次划线培养，获得纯菌株。

1.2.4 乳酸菌的鉴定 对分离纯化得到的疑似菌株进行形态特征鉴别、革兰氏染色、过氧化氢酶实验，然后进一步进行生理生化鉴定。

1.2.5 生长曲线实验 待测菌株接种于MRS液体培养基中，30℃、200r/min下培养18h。吸取一定量菌株培养液接种到MRS液体培养基中，30℃下培养，每隔一定时间取样，于680nm下测定OD值。

1.2.6 耐盐性实验 待测菌株接种于MRS液体培养基中，30℃、200r/min下培养18h。吸取一定量菌株培养液接种到NaCl含量（质量分数）为0、3%、6%、9%、12%、15%的MRS液体培养基中，30℃下培养48h，于680nm下测定OD值。

1.2.7 蛋白酶活的测定 采用分别添加15%脱脂牛乳的MRS和营养琼脂固体培养基作为测定蛋白酶活力的专用培养基。将待测菌接种于MRS液体培养基中，于30℃，200r/min下培养18h后，无菌吸取0.1mL培养液，接种于蛋白酶检测专用培养基中，涂布均匀，30℃下培养48h，若菌落周围有透明环，则为有阳性。

1.2.8 脂肪酶活的测定 采用分别添加15%牛油、中性红指示剂的MRS和营养琼脂固体培养基作为测定脂肪酶活力的专用培养基。将待测菌株接种于MRS液体培养基中，于30℃、200r/min下培养18h后，无菌吸取0.1mL培养液，接种于脂肪酶检测专用培养基中，涂布均匀，30℃下培养48h，若培养基上出现红色斑点，则为阳性。

2 结果与讨论

2.1 盐干带鱼加工过程中微生物的消长规律

实验中研究了盐干带鱼加工过程中微生物的消长规律，结果如图1所示。其中带鱼的起始细菌总数为4.39log cfu/g，符合国家食品一级品标准。由图可知，随着加工时间的延长，带鱼中细菌总数、酵母、乳酸菌、葡萄球菌和微球菌均呈现逐步增加趋势；其中风干阶段微生物增长迅速，这主要是干燥温度、带鱼中水分含量等条件适合微生物的生长繁殖。经风干6d后，带鱼中细菌总数增至6.24log cfu/g，乳酸菌和酵母的数量分别增加到5.28log cfu/g和4.38log cfu/g，葡萄球菌和微球菌的总量上升至4.82log cfu/g，这表明各检测的微生物之间不存在数量上的显著性差异，其中乳酸菌是盐干带鱼的主要优势菌群之一。

图1 盐干带鱼加工过程中微生物的变化

2.2 盐干带鱼中乳酸菌的分离鉴定

2.2.1 盐干带鱼中乳酸菌的初步鉴定 本实验采用MRS选择性培养基，从盐干带鱼中分离纯化得到单一菌株，经显微观察菌落形态、革兰氏染色、过氧化氢酶实验，得到G+、H2O-2菌株19株，初步鉴定均为乳酸菌，且分别编号为乳酸菌YG-1～YG-19。

2.2.2 盐干带鱼中乳酸菌的生理生化鉴定 对上述19株乳酸菌进一步进行生理生化鉴定实验，结果如表1。所有乳酸菌菌落为白色或乳白色，产酸，可水解明胶和淀粉；查阅细菌鉴定手册［9］，初步确定乳酸菌主要为食品乳杆菌（6株）、短乳杆菌（5株）和戊糖乳杆菌（2株），尚有6株未能鉴定其种类。其中食品乳杆菌为盐干带鱼产品中的优势乳酸菌之一，从菌株数量来说较多。该结果与传统肉制品的微生物区系研究具有较大的差异，如干腌牛肉Cecina产品中乳酸菌属细菌主要是食品乳杆菌、戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、发酵乳杆菌、香肠乳杆菌等，其中植物乳杆菌、发酵乳杆菌为优势菌［10］；云南干腌火腿中乳酸菌主要是植物乳杆菌、发酵乳杆菌、弯曲乳杆菌和干酪乳杆菌［11］，这可能是由于加工原料和工艺的不同所导致的。

表1 乳酸菌的生理生化鉴定

2.3 乳酸菌的生长曲线

实验中随机从分离得到的食品乳杆菌、短乳酸菌和戊糖乳杆菌中各挑选1株菌株进行生长曲线研究，结果如图2所示。由图可知（OD值均稀释计算得到），三类乳酸菌均具有良好的生长特性，其中食品乳杆菌YG-16和短乳杆菌YG-12表现出相似的生长特性，4h后进入生长对数期，12h后达到生长稳定期，而戊糖乳杆菌YG-18在培养4h后进入生长对数期，16h后才趋于生长平缓。比较OD680nm可知，食品乳杆菌YG-16和戊糖乳杆菌YG-18的生长速率高于短乳杆菌YG-12。

图2 乳酸菌的生长曲线

2.4 乳酸菌的耐盐性

传统盐干加工多为高盐腌制，鱼体内食盐含量较高，而食盐对微生物的生长有着明显的影响。为此，本实验考察了食品乳杆菌、短乳杆菌和戊糖乳杆菌的耐盐性，结果如图3（OD值均稀释计算得到）。研究发现，三类乳酸菌均受到NaCl的抑制作用，且呈现剂量负相关性；当NaCl浓度增至6%时，食品乳杆菌YG-16、短乳杆菌YG-12和戊糖乳杆菌YG-18的吸光度分别下降了17.2%、26.44%和46.79%；当NaCl浓度增至15%时，食品乳杆菌YG-16、短乳杆菌YG-12和戊糖乳杆菌YG-18的吸光度很低，基本无生长。以上结果表明，食品乳杆菌YG-16、短乳杆菌YG-12和戊糖乳杆菌YG-18均表现出较强的耐盐性，在含有9%～12%NaCl的培养基上仍能生长，其耐盐性关系为：食品乳杆菌＞戊糖乳杆菌＞短乳杆菌。

图3 乳酸菌的耐盐性

2.5 乳酸菌的蛋白酶活性与脂肪酶活性

实验中分析了食品乳杆菌、戊糖乳杆菌和短乳杆菌的酶活性，结果如表2。从表2可知，戊糖乳杆菌YG-18具有较弱的蛋白酶活性，食品乳杆菌YG-16和短乳杆菌YG-12未表现出蛋白酶活性；此外，三类乳酸菌的脂肪酶活性结果均呈现阴性，说明其不具有脂肪酶活性。

表2 乳酸菌的蛋白酶活性和脂肪酶活性

3 结论

3.1 盐干带鱼加工过程中，细菌总数、乳酸菌、酵母、葡萄球菌和微球菌的数量均呈现逐步增加趋势。

3.2 从盐干带鱼中分离得到19株乳酸菌疑似菌，经生理生化鉴定初步确定为食品乳杆菌（6株）、短乳杆菌（5株）、戊糖乳杆菌（2株），其余6株乳酸菌未能鉴定其种类。

3.3 食品乳杆菌、戊糖乳杆菌和短乳杆菌均具有良好的生长性能和耐盐性，在含有9%～12%NaCl的培养基上仍能生长。

3.4 食品乳杆菌、戊糖乳杆菌和短乳杆菌均未表现出脂肪酶活性，且仅有戊糖乳杆菌具有弱蛋白酶活性。

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Identification and biological characteristics of Lactic acid bacteria in cured hairtail（Trichiurus haumela）

CHEN Xue-yun，HOU Lu-na，DING Yu-ting，NIE Xiao-hua*
（College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310014，China）

The microbial changes during the process of cured hairtai（lTrichiurus haumela）were investigated，and the identification and biological characteristics of Lactic acid bacteria from cured products were also studied.From the results，the counts of total aerobic bacteria，yeast，Lactic acid bacterial，staphylococci and micrococci have been found to increase gradually throughout process，especially at air-drying stage.Lactic acid bacterial were considered as dominant microbe during the cured process.19 strains of Lactic acid bacterial were isolated from the product and identified as Lactobacillus paralimentarius，Lactobacillus brevis and Lactobacillus Pentosus.All of the identified Lactic acid bacteria exited good growth characteristics and salt endurance.Moreover，they have no lipase and only lactobacillus Pentosus has slight protease activity.

cured hairtail；Lactic acid bacteria；identification；biological characteristics

TS254.1

A

1002-0306（2010）11-0165-03

2009-10-10 *通讯联系人

陈学云（1984-），男，硕士研究生，研究方向：食品生物技术。

国家863项目（2007AA09Z442）。