鱿鱼骨壳聚糖的抑菌性能研究

姜启兴，乌 德，赵黎明，邹玉萍，于沛沛，夏文水，*

（1.江南大学食品学院，江苏无锡214122；2.华东理工大学生物工程学院食品科学与工程系，上海200237）

鱿鱼骨壳聚糖的抑菌性能研究

姜启兴1，乌 德1，赵黎明2，邹玉萍1，于沛沛1，夏文水1，*

（1.江南大学食品学院，江苏无锡214122；2.华东理工大学生物工程学院食品科学与工程系，上海200237）

研究了鱿鱼骨壳聚糖对食品中常见微生物的抑制作用，以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉等为受试菌，研究了2种不同相对分子量的鱿鱼骨壳聚糖（1210、844kD）的抑菌性能，并探讨了壳聚糖抑菌作用的稳定性。结果表明，两种壳聚糖对四种菌都有明显的抑制作用，相应最小抑菌浓度对大肠杆菌为0.02%，对金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉均为0.05%，壳聚糖的抑菌作用具有良好的热稳定性。

鱿鱼骨壳聚糖，抑菌作用，稳定性

壳聚糖是一种由甲壳素脱乙酰化得到的碱性阳离子多糖，其分子表现出多种独特的生物活性和功能，已在医学、食品和化工等领域得到广泛的应用［1-3］。不同甲壳素根据结构可分为三大类，即：从蟹虾壳中提取的α-甲壳素，从海洋软体动物骨骼中提取的β-甲壳素，从昆虫外壳中提取的 γ-甲壳素［4］。甲壳素经脱乙酰化后即得到壳聚糖。目前，关于壳聚糖的报道大多数都是关于来源于虾蟹壳的α-壳聚糖的报道，而关于β-壳聚糖的报道很少。β-壳聚糖其分子链为平行排列，有别于虾蟹壳制成的α-型的逆平行排列，一般认为β-壳聚糖具有较高的生化活性，而α-型的分子结构最稳定。本实验主要是在前期提取得到的鱿鱼骨壳聚糖（一种β-壳聚糖）的基础上，进一步研究其抑菌能力，为它将来的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

鱿鱼骨壳聚糖 C1：脱乙酰度90%、分子量1210kDa；C2：脱乙酰度90%、分子量844kDa，自制；金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黑霉菌、啤酒酵母 均由江南大学食品学院基础实验室提供；冰醋酸、NaCl、葡萄糖等 均为分析纯；牛肉浸膏、蛋白胨、酵母膏、琼脂 生化试剂。

SPX型智能生化培养箱 南京实验仪器厂；CRDX-280手提式灭菌锅 上海申安医疗器械厂；WHZ UV-2100紫外可见分光光度计 尤尼柯（上海）仪器有限公司；电子精密天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 对细菌生长抑制曲线的测定 称取一定量的鱿鱼骨壳聚糖，用营养肉汤培养基将其稀释成为某一浓度，调整pH为7.0，接入1mL的细菌菌种液，以不加壳聚糖的肉汤培养基混合液作为空白对照，置于37℃下恒温振荡培养，定时取样测定其吸光度值，用吸光度值的变化反映浊度的变化，即细菌数量的变化［4-8］。

1.2.2 对酵母生长抑制曲线的测定 称取一定量的鱿鱼骨壳聚糖，用土豆培养基将其稀释成为某一浓度，调整pH为7.0，接入1mL的啤酒酵母菌液，以不加壳聚糖的土豆培养基混合液作为空白对照，置于28℃下恒温振荡培养，定时取样测定其吸光度值。

1.2.3 对霉菌生长抑制曲线的测定 称取一定量的鱿鱼骨壳聚糖，用土豆培养基将其稀释成为某一浓度（最低抑菌浓度），调整pH为7.0，接入1mL的黑曲霉孢子悬浮液，置于30℃下恒温培养，定时取样，用布氏漏斗抽滤。收集菌丝体，洗净，置烘箱中烘干后称重。

1.2.4 最低抑菌浓度（MIC）的测定 采用琼脂稀释法。选取抑菌能力较好的鱿鱼骨壳聚糖进行最低抑菌浓度实验，用2倍稀释法配制得到各种浓度鱿鱼骨壳聚糖溶液，分别用无菌吸管定量将该溶液加入至已灭菌的培养皿中，然后分别加入一定体积已熔化并降温至45℃的营养琼脂培养基或麦芽汁琼脂培养基中，摇匀，倒平板，加入 0.1mL含菌量为107CFU/mL的菌悬液，涂布。细菌在37℃恒温倒置培养24h，霉菌和酵母在28℃恒温倒置培养48h，无菌生长的培养皿中防腐剂的最低浓度即为防腐剂的最低抑菌浓度（MIC）［8］。

1.2.5 加热温度对鱿鱼骨壳聚糖抗菌活性的影响鱿鱼骨壳聚糖溶液，予以 121℃、15min，100℃、15min，80℃、15min处理，用平板稀释法测定鱿鱼骨壳聚糖经不同温度处理后的抑菌率，以未经热处理的壳聚糖抑菌率为100%，计算相对抑菌率。其中鱿鱼骨壳聚糖的浓度为各种菌的最低抑菌浓度［9］。

2 结果与讨论

2.1 对大肠杆菌的生长抑制实验

以大肠杆菌为对象菌，研究了鱿鱼骨壳聚糖对其的抑制效果，图1是两种不同分子量的鱿鱼骨壳聚糖C1、C2对大肠杆菌的生长抑制曲线图。

图1 鱿鱼骨壳聚糖抑制大肠杆菌的生长曲线

从图1中看出，两种鱿鱼骨壳聚糖在浓度相同的情况下，C1能完全抑制大肠杆菌的生长，即使培养了40h后，其培养基的OD值仍低于0.2。C1和C2对大肠杆菌的生长抑制曲线的最大差别出现在延滞期，但最终在稳定期重合，说明C1比C2更能延长大肠杆菌对数生长期的到来，但抑制大肠杆菌总数的能力等同于C2。

2.2 对金黄色葡萄球菌的抑制

以金黄色葡萄球菌为对象菌，研究了鱿鱼骨壳聚糖对其的抑制效果，图2是两种不同分子量的鱿鱼骨壳聚糖C1、C2对金黄色葡萄球菌的生长抑制曲线图。

图2 鱿鱼骨壳聚糖抑制金黄色葡萄球菌的生长曲线

从图2中可以看出，两种鱿鱼骨壳聚糖均对金黄色葡萄球菌有较好的抑制效果，在实验浓度条件下，鱿鱼骨壳聚糖可显著延长其延滞期，且分子量较大的C1比C2抑制效果更显著。

2.3 对啤酒酵母的抑制作用

以啤酒酵母为对象菌，研究了鱿鱼骨壳聚糖对其的抑制效果，图3是两种不同分子量的鱿鱼骨壳聚糖C1、C2对啤酒酵母的生长抑制曲线图。

图3 鱿鱼骨壳聚糖抑制啤酒酵母的生长曲线

从图3中可以看出，两种鱿鱼骨壳聚糖均对啤酒酵母有较好的抑制效果，在实验浓度条件下，鱿鱼骨壳聚糖可显著延长其延滞期的作用，且分子量较大的C1比C2抑制效果更显著。

2.4 对黑曲霉的抑制作用

以黑曲霉为对象菌，研究了鱿鱼骨壳聚糖对其的抑制效果，图4是两种不同分子量的鱿鱼骨壳聚糖C1、C2对黑曲霉的生长抑制曲线图。

图4 鱿鱼骨壳聚糖抑制黑曲霉的生长曲线

从图4中看出两种鱿鱼骨壳聚糖在浓度相同的情况下，C1、C2均能显著延长黑曲霉的延滞期，即使培养了40h后，其培养基的OD值仍低于0.2。相对分子质量较大的C1的抑菌效果略好于C2。

从图1～图4中可以很明显地看出，两种不同分子量的鱿鱼骨壳聚糖对四种微生物均有一定的抑制能力，但C1（1210kDa）的抑菌能力要明显高于C2（844kDa），但也有很多研究表明，在某一分子量范围内，壳聚糖的分子量越小其抑菌能力越大，所以要揭示壳聚糖的抑菌能力与分子量的关系，则需要进行进一步的实验研究。

2.5 最低抑菌浓度

最低抑菌浓度是描述抑菌能力的一个指标，鱿鱼骨壳聚糖的浓度在抑制微生物能力方面扮演着一个重要的角色，表1是鱿鱼骨壳聚糖C1在不同浓度下的抑菌情况。

表1 不同浓度鱿鱼骨壳聚糖C1的抑菌率（%）

从表1可以看出，鱿鱼骨壳聚糖C1对实验中用到的各种细菌、酵母和霉菌的抑制能力都很好，当壳聚糖的浓度只有0.001%时，也能很好地抑制大肠杆菌的生长，但对其他微生物的抑制效果却不太理想，其抑菌效率都低于20%。从以上数据可以看出，鱿鱼骨壳聚糖对革兰氏阴性菌的抑制能力大于对革兰氏阳性菌的抑制能力，其次是黑曲霉，而对啤酒酵母的抑制能力最低，说明壳聚糖对细菌的抑制能力强于对真菌的抑制能力。

在所实验的pH条件下，鱿鱼骨壳聚糖C1对革兰氏阴性菌大肠杆菌的最低抑菌浓度为0.02%，对啤酒酵母、黑曲霉等真菌以及革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度均为0.05%。

2.6 热处理对鱿鱼骨壳聚糖抑菌能力的影响

加热是食品保藏的重要方法，防腐剂作用的发挥与温度有协同作用，在防腐剂存在下杀死微生物所要求的温度比没有防腐剂存在时低得多，即在低于微生物失活的加热温度下，可增加微生物对于一些防腐剂的敏感性。但是有些防腐剂热稳定性很差，热处理往往会使其降解或发生反应，影响防腐剂的抑菌效果。因此，研究热处理对鱿鱼骨壳聚糖抑菌能力的影响具有非常重要的现实意义，结果如表2。

表2 热处理对鱿鱼骨壳聚糖抑菌能力的影响（%）

从表2可以看出，热处理对鱿鱼骨壳聚糖的抑菌能力影响较小，经处理后相对抑菌率均保持在88%以上，且随着处理强度的降低（温度降低），对抑菌能力的影响逐渐减少。经热处理后对不同微生物的抑菌能力的影响有所不同，相对而言，壳聚糖经热处理后对大肠杆菌的抑制能力变化不大，即使121℃处理15min其相对抑菌率仍能达到95%以上；而对于金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉，热处理对于壳聚糖抑菌能力的影响相对较大，经121℃处理15min相对不热处理的抑菌能力下降了11%左右。但是对于80℃处理15min这种程度的热处理对鱿鱼骨壳聚糖的抑菌能力影响很小，最多也只下降了5%，这也就有力地说明了此种壳聚糖可以很好地应用到果汁、牛奶等巴氏杀菌的食品中防腐。

3 结论

3.1 从鱿鱼骨中提取的壳聚糖能很好地抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉的生长，且壳聚糖 C1（1210kDa）的抑菌能力比壳聚糖 C2（844kDa）强。

3.2 鱿鱼骨壳聚糖C1对于大肠杆菌的最低抑菌浓度是0.02%，对于金黄色葡萄球菌、啤酒酵母、黑曲霉的最低抑菌浓度均为0.05%。

3.3 热处理对鱿鱼骨壳聚糖的抑菌能力影响较小，可应用到果汁、牛奶等巴氏杀菌的食品中。

［1］张木炎，赵松林，陈飞.壳聚糖及其衍生物在食品工业中的应用［J］.保鲜与加工，2008，8（3）：9-12.

［2］蒋挺大.甲壳素［M］.北京：化学工业出版社，2003：123.

［3］孟祥平，张普查，高丽飞.壳聚糖在食品工业中的应用［J］.农产品加工，2009（8）：81-84.

［4］Roberts G A F.Chitin Chemistry［M］.London：Macmillan Press Ltd，1992.

［5］夏文水，赵希荣.对羟基苯甲酸壳聚糖酯的抑菌活性研究［J］.食品科学，2007，28（2）：78-83.

［6］沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验［M］.北京：高等教育出版社，1999.

［7］LAWRENCE R，BLON W F，RICHARD L，et al.Antimicrobial efficacy of a new organicacidan-ionic surfactant against various bacterial strains［J］.Journal of Food Protction，1994，57（6）：496-501.

［8］诸葛健，李钟华.微生物学［M］.北京：科学出版社，2004.

［9］LEE R M，HARTMAN P A，OLSON D G，et al.Bactericidal and bacteriolytic effects of selected food-gradephosphates，using Staphylococcus aureus as a model system［J］.Journal of Food Protection，1994，57（4）：276-283.

［10］WANG Guang-hua.Inhibition and inactivation of five species of food borne pathogens by chitosan［J］.Journal of Food Protection，1992，55（11）：916-919.

Study on antimicrobial activity of squid pens chitosan

JIANG Qi-xing1，OULD Mohamed Dadda1，ZHAO Li-ping2，ZOU Yu-ping1，YU Pei-pei1，XIA Wen-shui1，*
（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Department of Food Science& Technology，School of Biotechnology，East China University of Science&Technology，Shanghai 200237，China）

The antimicrobial activity of squid pens chitosan with different molecular weigh（t1210，844kD）and same deacelylated degree（90%），was evaluated against some bacteria（Escherichia coli，Staphylococcus aureus，Aspergillum niger，and Saccharomyces cerevisiae）.The results showed that chitosans treatments could inhibit the growth of all the bacteria tested，and the inhibiting rate increased with the rising of chitosan’s molecular weight.The minimum inhibitory concentration of the chitosan（1210kD）was 0.02%to Escherichia coli，0.05%to other three kinds of microorganism.ln the meanwhile the effects of temperature on the antibiotic activity of chitosan（1210kD）were also assessed.lt showed that the chitosan had a good thermostability，which made it have a good anticorrosive application in fruit juice，milk only need pasteurization.

squid pens chitosans；antibiotic activity；stability

TS254.1

A

1002-0306（2010）12-0094-03

2010-01-18 *通讯联系人

姜启兴（1977-），男，博士研究生，讲师，研究方向：食品加工与保藏。

国家高技术研究发展计划（863）项目（2006AA09Z444）；广东省教育部产学研结合项目（2007A090302059）。