黄芪内生菌抑菌活性的研究

赵春杰，李国银，吕耀龙，李云飞

（1.内蒙古农业大学职业技术学院食品科学与工程系，内蒙古包头014109；2.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特010018；3.内蒙古蒙西高新技术集团公司，内蒙古乌海014014）

黄芪内生菌抑菌活性的研究

赵春杰1，李国银2，吕耀龙1，李云飞3

（1.内蒙古农业大学职业技术学院食品科学与工程系，内蒙古包头014109；2.内蒙古农业大学食品科学与工程学院，内蒙古呼和浩特010018；3.内蒙古蒙西高新技术集团公司，内蒙古乌海014014）

为了研究药用植物中内生菌的抗菌活性，以黄芪内生菌ZCJ2为材料，对其所产抑菌活性物质的抗菌谱、溶解性及稳定性等进行了系统研究。结果表明，菌株ZCJ2产生的抗菌物质具有较广的抑菌谱，对革兰氏阳性菌、阴性菌都有较强的抑制作用。抗菌物质为水溶性，但是在正丁醇、氯仿、丙酮中不溶解或微溶。抗菌提取物在pH3～12条件下抗菌活性稳定，对热处理、酸碱和紫外线处理具有非常好的稳定性，这可为寻找天然抗菌物质提供资源。

内生菌，抑菌作用，活性物质

抗生素的使用改变了细菌感染性疾病的治疗与防治，通过抗生素有效地控制了许多严重的细菌感染，抗生素饲料添加剂也在提高动物生长速度和饲料转化率等方面做出了巨大贡献。但是，随着抗生素的不断使用，其负面作用日益突出，抗生素可能导致的耐药性及药物残留愈来愈引起人类的关注。要保障畜牧业的安全生产，推广应用安全的抗生素和合成药物代替产品非常必要。植物内生菌存在抑菌活性具有普遍性，目前已经从植物内生菌中分离筛选到多种抗菌活性物质［1-5］。植物内生菌和植物是经历了漫长的进化形成的共生关系，据目前的研究报告显示，研究过的植物中——尤其是药用植物中分离得到的内生菌均含有与宿主植物相同或相似的活性成分，这些物质在农业、医药、畜牧及食品工业中具有重要的应用潜力［6-7］。我们在前面的研究中，已从黄芪植物中分离到了一株具有高抑菌活性的菌株ZCJ2，经鉴定为Bacillus subtilius的变种。本文对该菌的产抗菌物质的性质作了进一步的研究，为菌株ZCJ2所产抗菌物质的生产和应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菌株 黄芪内生菌ZCJ2由本实验室分离保藏；黄芪浸提液 称取新鲜无病害黄芪100g，切碎后用研钵磨碎，加入1000mL蒸馏水，115℃灭菌25min，三层滤纸过滤，1000r/min离心5min，除去沉淀，制备成黄芪浸提液，用于配制培养基；MMM培养基 NaCl 20.0g、MgSO4·7H2O 7.0g、MgCl2·5H2O 5.3g、KCl 0.7g、CaCl21.25g、FeSO4·7H2O 0.025g、CuSO4·5H2O 0.005g、K2HPO40.075g、谷氨酸钠2.0g、Tris base 6.1g、黄芪浸提液1000mL，pH调至7.4；BPY培养基 牛肉浸膏5.0g、蛋白胨10.0g、酵母膏5.0g、NaCl 5.0g、葡萄糖10.0g、加黄芪浸提液1000mL，pH为7.0～7.2；改进的Landy培养基 葡萄糖10.0g、L-谷氨酸钠5.0g、MgSO40.5g、KCl 0.5g、KH2PO41.0g、FeSO40.15mg、MnSO45.0mg、CuSO40.16mg、黄芪浸提液1000mL，pH为7.0～7.2。

表1 菌株ZCJ2产物的抗菌谱测定结果

表2 抗菌物质在不同溶剂中的溶解性

1.2 实验方法

1.2.1 抗菌物质的制备与浓缩 以MMM培养基作为种子培养基，培养18～24h，按5%接入MMM培养基中，在30℃，160r/min，振荡培养36h。按照文献报道方法［8］将菌株ZCJ2的发酵液经离心除菌后，用旋转蒸发仪在50℃条件下浓缩，冷冻干燥。无菌双蒸水溶解后进行活性测定。

1.2.2 抗菌活性的测定 参照细菌素Nisin的抗菌活性检测方法［9］。以大肠杆菌作为指示菌，将待测样品，用0.45μm细菌滤器过滤，采用牛津杯平板扩散法，37℃培养24h，用游标卡尺测其抑菌圈的直径（diameter of antibiotic circle，DAC），以抑菌圈的直径表示抗菌物质的抗菌活性［10］。

1.2.3 抗菌谱的测定 指示菌选用了16株，包括5株革兰氏阳性菌、3株革兰氏阴性菌和8株真菌。采用管碟法测定对16株不同的细菌和真菌的抗菌活性，细菌于各自适合的温度培养24h，真菌于30℃培养48h，用游标卡尺测量抑菌圈直径并记录抑菌结果，以抑菌圈的直径表示发酵液的抗菌活性，所有实验设3个重复［11］。

1.2.4 溶解性实验 将抗菌物质的粉末，分别按相同量加入水、甲醇、乙醇、正丁醇、氯仿、丙酮等充分振摇后静置1h，10000×g离心15min，以纯水为对照，取上清液在225nm波长测定各自的OD值。

1.2.5 抗菌物质对热的稳定性研究 将抗菌提取物于60、80、100、121℃处理30min后，10000×g离心15min，取上清液测抗菌活性。以未经热处理的提取物为对照，并以对照的抑菌活性为100%计算各处理抗菌活性的残存率。

1.2.6 抗菌物质对酸碱的稳定性研究 将抗菌提取物按一定比例添加于pH为1～14的无菌水中，于室温保持5h后，10000×g离心15min，取上清液用牛津杯法以大肠杆菌为代表菌株测定抑菌圈大小，比较酸碱对抗菌活性的影响。

1.2.7 抗菌物质对紫外线的稳定性研究 将制备好的抗菌物质溶液5份，加入无菌平皿中，铺成约5mm薄层，无菌条件下用40W紫外灯分别照射1、6、12、24h。制备指示菌平板，采用牛津杯法以大肠杆菌为代表菌株测抑菌活性，以未照射过的上清液为对照，观察并用游标卡尺测量抑菌圈的大小。

2 结果与分析

2.1 抗菌谱的测定

采用管碟法测定对16株不同菌的抗菌活性，由抑菌圈结果（见表1）可知，发酵上清液对除枯草芽孢杆菌以外的4株革兰氏阳性菌的抑菌圈直径均超过了15mm，抑制作用强；对3株革兰氏阴性菌的抑菌效果，除交替假单胞菌的抑菌圈略小于15mm外其余的抑菌圈也均超过15mm，抑制作用强；8株真菌均能不同程度地受到抑制，抑菌圈直径在15～29mm之间。由此可知，菌株ZCJ2产生的抗菌物质对16株不同种类的供试菌株具有明显的抑制作用，具有较广范围的抑菌谱。

2.2 抗菌物质的溶解性

溶解实验结果如表2，菌株ZCJ2产生的抗菌物质在水中溶解性良好，在纯甲醇中有少量不溶，纯乙醇中仅有部分溶解，而在正丁醇、氯仿、丙酮中不溶解或微溶。抗菌物质在水中溶解性良好有利于抗菌物质在饲料中的应用。

2.3 抗菌物质的热稳定性

在抗菌物质在实际应用中，要受到温度的影响，如果抗菌物质温度稳定性差，则很难在实际中得到广泛应用。实验结果（图1）可知，菌株ZCJ2所产抗菌物质在80℃以下处理30min，抗菌物质的抗菌活性几乎不变；100℃处理30min时也仅有约2%的损失率；121℃处理30min，抗菌活性损失11.08%；因此可知，抗菌提取物对热处理具有非常好的稳定性。

图1 温度对抗菌物质稳定性的影响

2.4 酸碱对抗菌物质的影响

从实验结果（见图2）来看，在pH3～12条件下抗菌物质的抗菌活性比较稳定，在1＜pH＜3和12＜pH＜14时抗菌活性有所损失。

图2 pH对抗菌物质抗菌活性的影响

2.5 紫外线对抗菌物质的影响

抗菌物质经不同时间紫外线照射后，抑菌能力没有发生明显的变化（见图3）。抑菌圈直径大小显示抗菌物质在紫外线照射0、1、6、12、24h后，对大肠杆菌的抗菌效果与对照没有显著的差异。可见，抗菌物质的抗菌活性经紫外线照射后保持较好的稳定性。

3 结论

在严格控制实验条件情况下，利用抑菌圈非常真实直观地反映出实验结果，得出准确的相关结论。ZCJ2菌株产生的抗菌物质有较广范围的抑菌谱，它对革兰氏阳性菌、阴性菌都有较强的抑制作用。

抗菌物质为水溶性，但是在异戊醇、三氯甲烷中不溶解。对菌株ZCJ2所产生的抗菌物质进行稳定性实验，所设置的温度和pH范围大、紫外线照射时间长，因此了解到抗菌提取物在pH 3～12条件下抗菌活性稳定，对热处理、酸碱和紫外线处理具有非常好的稳定性。这样对抗菌物质的稳定性进行研究比较全面细致，也表明该抗菌物质具有较好的应用潜力。目前，对于Bacillus subtilis产生抗菌物质的报道多为抗菌脂肽，本实验研究所获得的抗菌物质的性质也和报道的抗菌脂肽的性质相符合，因此，初步推断菌株ZCJ2所产生的抗菌物质为抗菌脂肽。

图3 紫外线对抗菌物质抗菌活性的影响

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Study on antimicrobial substance of endophytes from Milkvetch

ZHAO Chun-jie1，LI Guo-yin2，LV Yao-long1，LI Yun-fei3
（1.Department of Food Science and Engineering，Agriculture University Occupation Technical College of Inner Mongolia，Baotou 014109，China；2.College of Food Science and Engineering，Inner Mongolia Agricultural University，Huhhot 010018，China；3.Inner Mongolia Melic-Sea High-Tech Group Company，Wuhai 014014，China）

To study antibacterial activity of endophytes from medicinal plants，the antibacterial spectrum，solubility and stability of antibacterial active material strained form Milkvetch antimicrobial endophytes ZCJ2 were studied systematically.Results showed that the antibacterial matter produced from strain ZCJ2 had broad antibiogram and strongly inhibited Gram-positive bacteria and Gram-negative bacteria，and that the material was diffluent in the water and dissoluble or slightly soluble in butanol，chloroform，acetone，and that the material kept steady antibacterial activity in the condition pH 3～12，and it had good stability to heat and acid-base and ultraviolet treatment，which could be resources for nature antimicrobial products.

endophytes；bacteriostasis；active substances

TS201.1

A

1002-0306（2010）12-0118-03

2010-04-14

赵春杰（1978-），女，讲师，教研室主任，主要从事微生物与生物技术方面的研究。