超声波对酶法水解丝素作用的研究

李利军，吴启涛，杨 峰，黄永春，李彦青，赵小进

（广西工学院生物与化学工程系，广西柳州545006）

超声波对酶法水解丝素作用的研究

李利军，吴启涛，杨 峰，黄永春，李彦青，赵小进

（广西工学院生物与化学工程系，广西柳州545006）

以废蚕丝的再生丝素液为原料，研究了有无超声作用、底物浓度、时间、温度、pH、加酶量等因素对碱性蛋白酶水解制备丝素肽的影响。结果表明，超声辅助酶解再生丝素液制备丝素肽最佳工艺为：底物浓度4.0%、酶浓度为4.0%、反应温度为45℃、反应时间为40min、pH为10.0、超声功率为200W。与水浴酶解相比，超声作用没有改变回收率与水解温度、pH、底物浓度、加酶量等因素的变化关系；但超声作用可提高回收率，缩短反应时间。

废蚕丝素，超声，酶解，丝素肽

将家蚕废丝水解成具有水溶性的丝素肽，是家蚕蚕丝开发应用的重要途径之一［1-2］，目前，该类产品已被应用在功能食品、高档化妆品和医用生物材料等领域［3-4］。制备丝素肽或混合氨基酸的传统工艺是将蚕丝通过脱胶处理后再被酸、碱及酶降解而成［5］。一般采用酸水解法，但酸水解易使部分氨基酸破坏，水解难以控制。利用酶促反应进行蛋白质水解，组成的氨基酸都不会被破坏，且反应条件温和、效率高、专一性强、酶解程度容易控制。已有报道利用肌动蛋白酶水解丝素，主要生成低聚肽和氨基酸［6］。还有学者研究了纯胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶对丝素的作用，据报道丝素的非结晶区被水解，而结晶区未能被水解，产生沉淀（60%～90%，因酶的纯度不同而有差异）［7］。倪莉等［8］研究了Alcalase碱性蛋白酶酶解可溶性丝素粉末的最佳工艺条件，并对丝素的酶解产物进行凝胶过滤色谱（SEC）的分析。由于声强超过一定值时，超声波可改变传声媒质的状态、性质及结构［9］，尽管对不同酶、底物作用效果不尽一致，其作用机理尚不清楚，但是它能提高许多化学反应的反应速度，改善目的产物的选择性，这些都引起了许多学者的关注［10］。本研究在盐溶脱胶丝素制备再生丝素液的基础上，采用碱性蛋白酶在超声波辅助下水解制备丝素肽，并与水浴水解优化条件加以比较。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

家蚕废丝（汰头） 由柳州市汇利丰茧丝有限责任公司提供；碱性蛋白酶（20万u/g）、中性蛋白酶（20万u/g）、木瓜蛋白酶（80万u/g） 南宁庞博生物工程有限公司生产；苦味酸胭脂红指示剂［9］取0.4g苦味酸溶于100mL水，0.5g胭脂红溶于100mL热水，二者等体积混合；双缩脲试剂［11］1.5g五水硫酸铜加入6g酒石酸钾钠溶于500mL水中，搅拌加入300mL 10%的氢氧化钠溶液，稀释至1000mL。

电子天平 0.0001g，AdventurerTM made for OHAUS corp.；HK-1D型恒温水槽 南京物化智能设备有限责任公司；电热恒温干燥箱 上海跃进医疗器械厂；超声波药品处理机 济宁金百特工程机械有限公司；酸度计 PHS-25 Precision pH/mV Meter；截留范围8000～14000D、φ34mm透析袋 上海源叶生物科技有限公司进口分装；离心机 常州国华电器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 再生丝素液的配制 将废蚕丝先用40℃温水浸泡30min，再浸渍于煮沸的0.5%碳酸钠溶液（浴比1∶30）中脱胶［12］1.5h，然后取出洗净、干燥，并用苦味酸胭脂红指示剂检验脱胶是否完全。用40%CaCl2溶液煮沸搅拌直至溶解，溶液为黄棕色。将溶解的丝素置于截留范围8000～14000Dφ34mm透析袋中，分别以自来水、蒸馏水流动透析2d，直至透析液电导率小于1×10-5Ω-1，可认为丝素液总小分子已被处理掉，称之为再生丝素液，取样烘干测其浓度，即含固量。一般浓度在4%～6%（W/V，相当于40～60mg/ mL）左右，临用前稀释。

1.2.2 酶母液的配制 用电子分析天平准确称量所需酶制剂2.000g，溶于25mL中性缓冲液中，临用前配制80g/L酶母液。

1.2.3 单因素酶解实验 取40mL一定浓度的上述再生丝素液，加入相应缓冲液混合，微调至需要的pH。水浴中恒温10min，以达到反应温度，同时将恒温5min酶母液加入上述混合物中，混匀酶解，并开始计时，酶解过程中用0.5mol/L NaOH和盐酸维持酶解pH恒定。到预定时间，迅速煮沸酶解液15min灭活蛋白酶。冷却后，4000r/min 10min离心分离，将上清液和沉淀分别收取，待测。定容上清液到同一体积，测定不同条件下产品的回收率和吸光度。同时按上述工艺在超声波辅助作用下考察丝素酶解情况。

1.2.4 双缩脲反应及吸光度的测定 水解液中多肽含量通过双缩脲反应比色来衡量。吸光度越大，水解液中多肽含量越大。取水解脱色样液1mL，加入4mL双缩脲试剂，充分混匀，静置30min后，用722型分光光度计在波长540nm处，以1mL蒸馏水加4mL双缩脲试剂做空白对照，测定吸光值。

1.2.5 产品回收率的测定 准确量取水解液总体积，记为V0，取体积V1倒入烘干至恒重的培养皿中（记皿重为M1），加热干燥至恒重，记培养皿与干物质总质量M2，M为进行水解的脱胶丝质量，g。用下式计算回收率：

回收率（%）=（M2-M1）/M×V0×V1×100%

2 结果与讨论

2.1 不同超声频率对丝素液水解的影响

如表1所示，取40mL 4%的再生丝素液，酶用量4.0%，在45℃分别用频率为26、48、69kHz超声在200W作用下水解40min，维持水解过程 pH恒为10.0。实验结果显示，在同一功率水解再生液前提下，超声频率为26kHz时回收率最高，达到77%以上，吸光度变化不大。

表1 超声波在同一功率的不同频率对丝素液水解影响

2.2 不同超声功率对丝素液水解的影响

取40mL 4%的丝素液，保持pH为10.0，酶用量4.0%，40℃用频率为26kHz超声依次在110、175、200、245和290W水解40min。实验结果见表2，酶解液双缩脲显色反应均显紫红色，证明存在丝素肽。同样方式处理的酶解液在540nm处吸光度先增后减，说明超声辅助酶解丝素存在最佳功率，回收率在200W时达到较大的69%以上，故可以认为最佳超声功率为200W。

表2 26kHz超声波的不同功率对丝素液水解的影响

2.3 不同酶浓度对丝素水解的影响

取40mL 5%的再生丝素液，加酶母液，并调pH为8.0，在55℃摇床中水浴酶解5h，调节酶浓度依次为2%、3%、4%、5%和6%（w/v）。其它条件不变，保持pH为10.0，40℃用频率为26kHz超声在200W作用下依次水解30min。实验结果如图1、图2所示，水浴酶解回收率最高达65.71%时，酶浓度为5%，超声辅助酶解最佳加酶量为5%。

图1 酶浓度对回收率的影响

2.4 不同pH对丝素水解的影响

取40mL底物浓度为5%的再生丝素液，加5%的酶母液（即取80g/L酶母液1.25mL加入到待酶解溶液中），并在55℃摇床中水浴酶解5h，调节pH为7.0、8.0、9.0、10.0、11.0。其它条件不变，保持酶用量5.0%，40℃用频率为26kHz超声波在200W作用下超声水解40min。实验结果如图3、图4所示，酶解回收率和吸光度都高时，水浴酶解和超声辅助酶解的pH均为10.0。

2.5 不同底物浓度对丝素水解的影响

如图5，对40mL再生丝素液，调节浓度依次为2%、3%、4%、5%和6%，加5%酶母液，并调pH为10.0，在55℃摇床水浴酶解5h。结果显示，底物浓度为5%时，水浴酶解回收率达到60%以上，吸光度为0.438。其他条件不变，控制底物浓度为2.0%、4.0%、6.0%、8.0%和10.0%，酶用量5.0%，40℃用频率为26kHz超声波在200W作用下超声水解40min，实验结果见图6，4.0%的底物浓度使回收率和吸光度较大。

图3 酶解pH对回收率的影响

图4 酶解pH对肽含量的影响

图5 底物浓度对水浴酶解效果的影响

图6 底物浓度对超声辅助酶解的影响

2.6 不同酶解时间对丝素酶解的影响

40mL 5%的再生丝素液，加5%的酶母液，并调pH为10.0，在55℃摇床水浴酶解，反应时间依次为1、2、3、4和5h，结果见图7，酶解液吸光度随时间延长而降低，回收率逐渐升高，在2h时二者能同时出现相对较大值，故较好的酶解时间为2h。同样，在其他条件不变，40℃用频率为26kHz超声在200W作用下依次水解20、30、40和50min，由图8所示，超声40min，回收率达最大，为57.49%，此时吸光度相对较大，为0.498，所以，超声辅助酶解较好反应时间为40min。

2.7 不同反应温度对丝素酶解的影响

如图9所示，取40mL 5%的再生丝素液，加5%的酶母液，并调pH为10.0，在恒温水槽中水浴酶解2h，改变反应温度为40、45、50、55和60℃，水浴水解的回收率和吸光度较大时都在45℃处；其它条件不变，用频率为26kHz超声在200W作用下分别在30、40、45和50℃酶解40min，酶解回收率和吸光度都高时，反应温度也为45℃，见图10。

图7 反应时间对水浴酶解的影响

图8 反应时间对超声辅助酶解的影响

图9 不同温度对水浴酶解效果的影响

图10 不同温度对超声辅助酶解的影响

2.8 酶解丝素最优条件验证

由单因素实验得到水浴酶解再生丝素液较优方案为丝素液5%，45℃，pH为10.0，酶浓度为5%，处理120min，平行7次实验，求平均值，得到回收率为66.8%，540nm处吸光度为0.473；按超声辅助酶解丝素液优化方案为4%的丝素液，45℃，pH为10.0，酶浓度为4.0%，用26kHz频率超声在200W作用下处理40min，平行7次实验，酶解液平均回收率为77.87%，540nm处吸光度为0.558。

3 结论

3.1 与水浴酶解相比，超声作用没有改变回收率与水解温度、pH、底物浓度、加酶量之间关系曲线的变化趋势，也没改变碱性蛋白酶水解丝素再生液最佳反应温度和最佳pH，但使回收率和丝肽含量增加10%以上。

3.2 同一功率不同频率超声波对碱性蛋白酶水解再生丝素液作用不同，26kHz低频率超声利于酶解；不同功率的超声波对酶解丝素蛋白作用也不同，其中200W功率超声对酶解影响最大。

3.3 再生丝素液经碱性蛋白酶酶解制备丝素肽最佳工艺为：底物浓度4.0%、酶浓度为4.0%、反应温度为45℃、反应时间40min、pH为10.0、超声功率为200W。

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Study on the effect of ultrasound on fibroin hydrolyzed by protein enzymes

LI Li-jun，WU Qi-tao，YANG Feng，HUANG Yong-chun，LI Yan-qing，ZHAO Xiao-jin
（Dept.of Biochemical Engineering，Guangxi University of Technology，Liuzhou 545006，China）

Taking regenerated solution of waste silk fibroin as material，the effects of the application of ultrasound，reactant concentration，time，temperature，pH and enzyme concentration on silk peptide hydrolyzed by alkaline protein enzyme and silk amino acid mixture were investigated by using single factor experiment.The optimal parameters were：reactant concentration 4.0%，enzyme concentration 4.0%，extraction temperature 45℃，reaction time 40min，pH 10.0，ultrasound power 200W.Compared with water bath hydrolyzing，ultrasound-assisted reaction is more effective with advantages in short reaction period and improving response rate.Though it cannot change the relationship among the recovery rate and reactant or enzyme concentration，temperature，pH，it can increase recovery rate and shorten time.

waste silk fibroin；ultrasound；enzyme hydrolysis；silk peptide

TS209

B

1002-0306（2010）12-0276-04

2009-12-25

李利军（1966-），男，博士，研究方向：应用化学。