代谢调控物对红酵母累积番茄红素的影响

王海兵，吴晓英，洪秀云

(华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州，510006)

代谢调控物对红酵母累积番茄红素的影响

王海兵，吴晓英，洪秀云

(华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州，510006)

黏红酵母是一种可以生产类胡萝卜素的单细胞真菌，番茄红素是一种未环化类胡萝卜素，可以运用代谢控制手段，调控和阻遏某些相关的反应，使其累积番茄红素。作者基于红酵母中类胡萝卜素的合成途径，对环化抑制剂烟碱、麦角固醇合成抑制剂酮康唑、MoG还原酶激活剂青霉素、氧化剂过氧化氢等代谢调节物的调控条件进行了研究，发现添加一定量的上述代谢调控物质确实可以促进黏红酵母中番茄红素的累积。试验中采用均匀设计法优化了代谢调控的条件，研究结果表明，分别在发酵的24 h加入烟碱2.5mL/L和青霉素4 mg/L，36h时添加双氧水1.2mL/L，60h时添加酮康唑400 mg/L，可以使番茄红素累积量达到176.97 mg/L，是未用代谢调控时番茄红素产量4.10 mg/L的43.2倍。

红酵母，番茄红素，代谢调控

番茄红素是一种具有11个共轭双键的不饱和碳氢化合物，为类胡萝卜素的一种，是很重要的生物活性物质，在预防和治疗前列腺癌、乳腺癌等癌症，增强人体免疫功能以及心血管疾病方面有着巨大的潜力［1－3］。

目前国内外应用的番茄红素的来源主要有2方面:植物提取法和微生物发酵法。用植物提取法制取番茄红素，虽然原料来源广泛易得，但是含量较低、副产物较多，原料供应受到气候与季节的影响较大，使得生产成本较高;与此相比，微生物发酵法具有生产周期短、生产菌可通过基因改造而大幅提高产量，易于放大和工业化生产。目前，生产天然类胡萝卜素的主要菌种有三孢布拉氏霉(Blakeslea trispora)和红酵母(Rhodotorular)。虽然与三孢布拉氏霉相比，红酵母的单位产量比较低，但由于其具有营养要求简单、生长周期短及菌体营养丰富等许多优点，具有很高的实用价值和很好的工业开发前景。

一般情况下，微生物合成的主要类胡萝卜素，是番茄红素经过环化和氧化等之后的衍生物，如β-胡萝卜素、玉米黄素、虾青素等［4］。因此，针对类胡萝卜素这样的一个合成途径［5］，可以从3方面提高番茄红素的累积:1是要加强和促进类胡萝卜素合成途径，2是要控制番茄红素后续反应的过程，阻止其环化反应，3是阻遏其他的竞争代谢途径，使其代谢向有利于合成番茄红素的方向进行。本文就不同代谢调节物对番茄红素合成的影响进行了研究。

1 材料与方法

1.1 菌种

本实验室筛选得到的1株产番茄红素的黏红酵母2.27。

1.2 主要仪器和试剂

番茄红素标准品，上海融和医药公司;烟碱(95%)，西安天则生物技术有限责任公司;双氧水(含体积分数30%H2O2的水溶液)，广州化学试剂厂;酮康唑，广州迪越化工有限公司;青霉素，广州美津生物技术有限公司。

SHP－450D型生化培养箱，上海森信实验仪器有限公司;SKYB2112B型恒温摇床，广州科桥实验技术设备有限公司;LD5－2A低速离心机，北京医用离心机厂;2802S型紫外分光光度计，尤尼科(上海)仪器有限公司;Waters高效液相色谱仪1525，Waters紫外分光检测器2487。

1.3 培养基与培养方法

斜面活化培养基:葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉10g/L，琼脂20g/L，自然pH。

液体种子培养基:葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸出粉10g/L，自然pH。

液体发酵培养基:葡萄糖50g/L，蛋白胨15g/L，酵母粉10g/L，初始pH 5，核黄素 0.5 mg/L，吐温－80 1.5%。

种子斜面活化培养:挑黏红酵母1环，接入斜面活化培养基中，28℃培养48 h。

液体种子培养:从活化了的斜面种子中挑取培养2环，接于装有30mL液体种子培养基的250mL三角瓶内，28℃下200 r/min振荡培养24 h。

液体发酵培养:以5%的接种量，将液体种子接入到装有25mL发酵培养基的250mL三角瓶中，在光照条件下，28℃，200 r/min振荡培养96 h。

1.4 生物量的测定

发酵结束后，取10mL液体发酵液转入离心管中，以4 000 r/min离心10 min，弃上清液，沉淀水洗后再次离心，得酵母泥，于55℃下过夜烘干，称干质量

1.5 番茄红素的提取

发酵结束后，参照文献采用热酸法破壁［8］，丙酮浸提:取发酵液10mL转入离心管中，以4 000 r/min离心10 min，沉淀水洗后得酵母泥;加入3mol/L的HCl溶液5mL，混合均匀后浸泡1.5 h，然后再沸水浴4 min，迅速冷却，再4 000 r/min离心10 min，得沉淀水洗2次，离心得到菌体残片;加入丙酮9mL，混合均匀，浸提1h，4 000 r/min下离心10 min，得到色素丙酮浸提液。

1.6 番茄红素含量测定方法

将色素提取液用0.22μm的微孔滤膜过滤后，以高效液相色谱法(HPLC)测定提取液中番茄红素的含量。同时配制不同浓度的标准品溶液，在相同条件下测定，根据峰面积制备标准曲线定量。

Waters－1525高效液相色谱仪;色谱柱为:Agilent HC C－18柱(5μm，250 mm ×4.6 mm);Binary高效泵;检测器为:Waters－2487，Double λ Absorbance Detector;数据分析软件:Breeze。

高效液相色谱条件:流动相为V(乙腈)∶V(二氯甲烷)=10∶90，检测波长为472 nm，流速为1.0mL/min，柱温为 28℃，进样量为 10μL。

2 结果与分析

2.1 番茄红素标准曲线

准确称量2.5 mg的番茄红素标准品，用丙酮溶解，定容于10mL的棕色容量瓶中，质量浓度为250μg/mL。再分别稀释成 50、100、150、200、250μg/mL的质量浓度梯度，经0.22μm滤膜过滤后HPLC检测，数据处理，得到峰面积与质量浓度的关系曲线为:y=10.892x，R2=0.998 4。

2.2 烟碱加入的不同时间对番茄红素累积的影响

在开始液态发酵后，分别在 6、12、18、24、30 h，以2.5mL/L的添加量加入烟碱，结果如图1所示。

图1 烟碱的加入时间对番茄红素合成的影响

从图1可以看出，随着时间的推移，加入烟碱后番茄红素的产量先高后低，在24 h加入时达到最大值11.51 mg/L;生物量一直随时间的延长而增大，在30 h加入时达到最大值21.44g/L。可能是由于烟碱对酵母菌细胞有一定的毒害作用，在发酵的早期加入会对黏红酵母生长不利，因而生物量较低。综合考虑，添加代谢调节物烟碱的时间为24 h。

2.3 酮康唑加入的不同时间对番茄红素累积的影响

液态发酵至24 h，添加2.5mL/L的烟碱后，再分别在发酵的 48、54、60、66、72 h，以 400 mg/L 的量加入酮康唑，对黏红酵母合成番茄红素的影响如图2所示。

图2 酮康唑的加入时间对番茄红素合成的影响

根据图2可知，随着酮康唑加入时间的推移，黏红酵母的生物量和番茄红素产量都先增大后减小，在发酵至60 h时加入酮康唑时两者都达到了最大值，分别为22.04g/L和87.27 mg/L。由于酮康唑可以抑制真菌细胞膜中麦角固醇的合成，使得更多的前体物质法尼基双磷酸酯(FPP)用于合成番茄红素，但过早的加入酮康唑，对酵母细胞的增殖会有一定的抑制作用，因此要在发酵达到稳定期再加入，故最适宜加入时间为60 h。

2.4 青霉素加入时间对番茄红素累积的影响

在发酵至24h时加入2.5mL/L烟碱，60h时加入酮康唑400 mg/L，然后分别在发酵的12、18、24、30和36 h，加入青霉素1 mg/L，对黏红酵母合成番茄红素的影响如图3所示。

图3 青霉素的加入时间对番茄红素合成的影响

从图3可以看出，在发酵前期添加青霉素，黏红酵母的番茄红素产量先增大后减小，24h时达到最大值103.33 mg/L。因此，作为MoG还原酶的激活剂的青霉素，最适宜加入时间为发酵至24h时。

2.5 双氧水加入时间对番茄红素累积的影响

在发酵至24h时加入2.5mL/L烟碱和1 mg/L青霉素，60h时加入酮康唑400 mg/L，然后分别在发酵的 24、30、36、42、48 h，加入双氧水量 1.6mL/L，对红酵母累积番茄红素影响如图4所示。

从图4可以看到，随着双氧水加入时间的向后推移，黏红酵母的生物量和番茄红素产量都是先增大后减小，42 h加入双氧水，生物量达到最大值25.98g/L;36h加入双氧水，产量达到最大值160.96 mg/L。由于酵母细胞对于双氧水的氧化刺激产生应激反应，从而促进了番茄红素的合成，但如果过早的加入，此时细胞浓度较低，对其继续增殖不利，加入时间太晚，又会消耗掉一些已经生成的番茄红素，因此，双氧水的最佳加入时间是黏红酵母发酵至36 h时。

图4 双氧水的加入时间对番茄红素合成的影响

2.6 各种代谢调控物质添加量的优化

从单因素实验结果得到几种代谢调节物的最佳加入时间点为:烟碱在发酵至24 h时加入，酮康唑在60 h时加入，青霉素在24 h时加入，双氧水在36 h时加入。为了进一步提高其代谢调控的水平，用均匀试验的方法对各种调节物的添加量进行了优化，各因素及水平的选取见表1。

表1 均匀设计试验各因素及其水平

由DPS数据处理系统得到的实验方案及实验所得结果如表2所示。

表2 均匀设计试验方案及结果

从表2可以看出，运用组合N1可以得到黏红酵母生物量和番茄红素产量的最大值，即烟碱2.5mL/L，酮康唑600 mg/L，青霉素4 mg/L，双氧水1.2mL/L的添加量时，可以得到番茄红素的最大产量176.97 mg/L

3 结论与讨论

本文研究了红酵母在发酵产生番茄红素过程中，添加番茄红素环化酶抑制剂、麦角固醇抑制剂、青霉素和氧化剂对番茄红素生物合成的影响。实验中以烟碱作为环化酶抑制剂的添加，可以阻遏类胡萝卜合成中番茄红素的环化［6］，使得番茄红素得以累积;由于麦角固醇和番茄红素的合成有共同的前体物质法尼基双磷酸酯(FPP)［7］，因此酮康唑的加入抑制了麦角固醇的合成，使得更多的FPP用来合成番茄红素［8－9］，其产量必然增加;青霉素作为MoG还原酶的激活剂，可以增加前体物质IDP的合成，促进番茄红素的合成［10］;双氧水为氧化剂，对黏红酵母的刺激增强了番茄红素的合成代谢流，才得以使番茄红素大量积累［11］。

采用均匀试验对几种调节物的添加量进行了优化，结合单因素确定的最佳添加时间，得到各调节物的添加方式为:24h时加入烟碱2.5mL/L，60h时加入酮康唑600 mg/L，24h时添加青霉素4 mg/L，36h时加入双氧水1.2mL/L，可使番茄红素得到大量的积累，达到176.97 mg/L，是不加效应物时番茄红素产量4.10 mg/L的43.2倍。

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Effect of Metabolism Regulating Agents on Biosynthesis of Lycopene in Rhodotorula

Wang Hai-bing，Wu Xiao-ying，Hong Xiu-yun
(School of Bioscience and Bioengineering，South China University of Techology，Guangzhou 510006，China)

Rhodotorula glutinis，a kind of caroteniod producing unicellular epiphyte，is widespread in nature.As lycopene is a carotenoid without cyclization，metabolic control means can be used to control and deter some of the related response to accumulate lycopene.On the basis of biosynthesis path of caroteniod in Rhodotorula，experiments were carried out to stduy the regulation conditions of the conditioners，such as cyclase inhibitor nicotine，ergosterol synthesis inhibitor ketoconazole，MoG reductase activator penicillin and oxidant hydrogen peroxide.We identified that lycopene was accumulated with adding this regulator above.The results revealed that the highest lycopene concentration was obtained when 2.50 ml/L nicotine，4mg/L penicillin，1.2mL/L aquae hydrogenii dioxide(30%Hydrogen peroxide)and 400mg/L ketoconazole were added respectively at 24h，24h，36h and 60h following Rhodotorula inoculation.It reached to 176.97mg/L，43.2 times of initial lycopene yield 4.10 mg/L.

Rhodotorula，lycopene，metabolic regulation

硕士研究生(吴晓英副教授为通讯作者)。

2010－08－05，改回日期:2010－06－25