双歧杆菌耐氧性研究及其应用*

赵建云，左芳雷，肖满，陈尚武

(中国农业大学食品科学营养工程学院，教育部北京市功能乳品重点实验室，北京，100083)

双歧杆菌耐氧性研究及其应用*

赵建云，左芳雷，肖满，陈尚武

(中国农业大学食品科学营养工程学院，教育部北京市功能乳品重点实验室，北京，100083)

双歧杆菌是存在于人和某些动物肠道中的功能益生菌，与机体的健康状况密切相关。由于其独特的生理功能优势，已经成为微生物学及临床医学等领域的研究热点之一。但双歧杆菌内部缺少有效的活性氧清除系统，对氧气十分敏感，限制了双歧杆菌的研究范围与实践应用。如何提高双歧杆菌的耐氧性能成为未来研究的重点。从双歧杆菌耐氧性及其耐氧机制、改善其耐氧性方法及耐氧双歧杆菌制品的应用前景等方面进行探讨，为今后双歧杆菌的应激理论研究及实际应用提供参考。

双歧杆菌，耐氧性，耐氧机制，氧化应激

双歧杆菌(Bifidobacterium)是人和动物肠道内数量最多、功能最重要的革兰氏阳性无芽胞菌。在长期进化过程中与宿主形成了和谐的依存关系，和其他厌氧菌一起定植于肠黏膜上皮细胞表面，形成一个生物学屏障，阻止致病菌的侵入［1］，对维持肠道的微生态平衡起着重要作用。双歧杆菌在体内具有预防和治疗腹泻、减轻便秘和乳糖不耐性症状、提高机体免疫力、抑制肿瘤发生、减少胆固醇等多方面作用［2］，应用领域十分广泛。

肠道内益生菌需要保持很高的活菌数才能发挥其生理功能，要达到治疗效果，每天至少摄入108CFU［3］，这就要求含有益生菌的食品生产和储存过程中，大量的益生菌必须保存下来。由于双歧杆菌在氧气和酸度较低的条件下，生长缓慢且容易死亡，对营养要求比较严格，造成培养的难度大，限制了其在食品中的应用。

为了扩大双歧杆菌研究与应用范围，双歧杆菌适应环境胁迫的研究逐渐增多，研究者分别从不同角度阐释双歧杆菌适应环境机制及菌体内自身的调节变化，但对于双歧杆菌耐氧性的研究还不是很深入，仅限于对氧胁迫引起的细胞水平的研究，对于分子方面的研究还很欠缺，而双歧杆菌的氧敏感性是一个普遍的、迫切需要解决的问题。本文就双歧杆菌耐氧性、耐氧机制、改善其耐氧性方法及耐氧双歧杆菌制品的应用前景等方面做一介绍，以期为今后双歧杆菌的氧化应激理论研究和实践提供参考。

1 双歧杆菌的耐氧性

双歧杆菌属于放线菌科革兰氏阳性菌，GC含量高、专性厌氧，过氧化氢酶阴性。有氧存在时，双歧杆菌会形成H2O2、O2－、HO·等活性氧［4］。HO·氧化活力最高，O－2次之，H2O2的氧化活力最弱。虽然H2O2是弱氧化剂，但过渡金属会使其转变成氧化活力高的HO·［5］。活性氧还能够扩散到细胞内，氧化并破坏细胞内的重要物质，如细胞膜脂质、酶和DNA，造成代谢障碍。

菌株不同，双歧杆菌对氧气的耐受性也不同。有关双歧杆菌耐氧性的研究较早的是1969年的de Vries［6］，通过检测20种双歧杆菌对氧气的敏感度，依据菌种在有氧环境下对氧气的耐受性和过氧化氢合成情况，将双歧杆菌分为了对氧气不太敏感、比较敏感、极度敏感的3类菌株。随后有关双歧杆菌对氧气敏感度的研究逐渐增多。Kawasaki［4］发现B.boum JCM 1211T和 B.thermophilum JCM 1207T能够在含20%氧气的环境下生长。Li Qingqing［7］分离鉴定了1株耐氧的双歧杆菌Bifidobacterium animalis subsp.lactis Qq08，比已商业化的菌株Bifidobacterium lactis Bb12更具有优良性能。

2 双歧杆菌的耐氧机制

正常情况下，生物机体拥有完整的氧化-抗氧化平衡机制，但当机体受外界环境毒害影响较大时，机体产生的活性氧及其他自由基不能有效地被抗氧化机制所清除，就会对机体产生毒害作用。

在特定环境下，H2O2、O2－等活性氧浓度超过细胞的清除能力时，会产生氧化应激。在应激条件下，细菌形成信号转导系统来感知周围环境的变化，并且控制与细胞防御机制有关基因的协同表达［8］。基因的表达通过转录水平的调控来实现，形成的防御系统有助于微生物在应激条件下的存活。

在环境氧气或者其他氧化物存在时，双歧杆菌会通过自身内部的调节进行氧化适应，尽可能满足自身生长的需求。总体来讲，其氧化应激途径主要有以下几种。

2.1 螯合金属离子

有氧存在时，双歧杆菌会形成H2O2、、HO·等活性氧。而超氧阴离子()和H2O2通过以下反应形成活性更高的羟基自由基HO·。

通过螯合金属离子，可以有效防止高活性氧的生成，减少不良氧化反应的进行。Meei-Yn等证实长双歧杆菌B6和15708具有较好的金属离子螯合能力，其中长双歧杆菌15708在试验菌株中具有最高的铜离子螯合能力［5］。研究表明双歧杆菌对多种自由基，如脂质过氧化产物等都有清除作用［9］。

2.2 抗氧化酶类

2.2.1 NADH氧化酶和NADH过氧化物酶

益生菌中的抗氧化酶如超氧化物歧化酶(SOD)、含锰假性过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶以及硫氧还蛋白还原酶、阿魏酸酯酶和巯基化合物等具有清除活性氧和自由基的作用。

双歧杆菌细胞内缺乏过氧化氢酶(CAT)活性，氧气的清除是由NADH氧化酶和NADH过氧化物酶决定的。Shimamura等［10］发现菌株的耐氧性与NADH氧化酶和NADH过氧化物酶活力呈正相关。Shin等［11］也认为大多数氧敏感双歧杆菌的NADH氧化酶和NADH过氧化物酶活力低，而大多数耐氧双歧杆菌的这两种酶活力高。Talwalkar等［12］研究表明，不同的氧气浓度促使双歧杆菌的NADH氧化酶活力提高1.5～3倍，NADH过氧化物酶活力提高1.5～2倍，可能是由于氧气诱导产生更多的NADH氧化酶和NADH过氧化物酶，以便抵制氧的毒性作用。还有研究显示NADH氧化酶和NADH过氧化物酶活力不是造成它们耐氧性差异的主要原因，酶的类型也影响双歧杆菌的耐氧性［4］。

这两种酶可能通过以下途径［13］将O2转化成无毒性的H2O，进而提高双歧杆菌的耐氧性。

2.2.2 超氧化物歧化酶(SOD)和其他酶

SOD是金属蛋白酶，通常在好氧菌和兼性厌氧菌中有Mn-SOD或Fe-SOD，在厌氧菌中有Fe-SOD，而Cu-SOD和Zn-SOD存在于真核细胞中［14］。

耐氧型和厌氧型双歧杆菌都具有SOD活性，但活力很低，并且彼此之间没有差异。虽然双歧杆菌具有SOD，但酶活力不因氧气诱导而增加，可见SOD不是双歧杆菌耐氧机制的关键因素［12］，但SOD可以通过以下途径将O2转化成H2O:首先通过反应将O2转化成，而后通过反应将转化成H2O2，最后将H2O2转化成H2O。

双歧杆菌的耐氧机制还可能涉及一些其他酶类。Schell等［15］对 B.longum NCC2705 的基因组序列进行了分析，发现了3种可能与双歧杆菌耐氧性有关的酶基因:巯基过氧化物酶基因、烷基过氧化物酶基因(ahpC)和肽蛋氨酸亚砜还原酶基因，这些酶能够抵制活性氧对蛋白质和脂质的氧化破坏。

2.3 其他途径

双歧杆菌细胞中存在着非酶的防御机制，充分利用其中的还原性成分来适应生长中氧含量变化。如双歧杆菌代谢产物(胞外多糖、脂磷壁酸)和巯基化合物等具有抗氧化活性。

环丙烷脂肪酸(CFA)是多数细菌细胞膜磷脂的重要组成部分，CFA与细菌的低温耐受力、酸耐受力、醇耐受力以及氧耐受力都有关系。Shin等［16］用GC-MASS分析双歧杆菌的脂肪酸组成后，表明双歧杆菌的CFA主要成分是9，10-亚甲基十八碳酸，耐氧长双歧杆菌含有该化合物，而氧敏感的青春双歧杆菌却不含有此物质。Ahn等［17］进一步研究发现，耐氧长双歧杆菌通过显著地增加9，10-亚甲基十八碳酸的含量来抵御环境中的氧胁迫。

3 改善双歧杆菌耐氧性的方法

为了避免双歧杆菌在益生菌制品的加工、包装、贮藏和摄入机体过程中大量失活，人们提出了很多解决双歧杆菌氧中毒的方法。

3.1 双歧杆菌的耐氧驯化

双歧杆菌要求在严格的厌氧环境下生长，这种特性不仅给试验和生产带来诸多不便，也给食品生产、运输和存储带来了很大困难。在食品和微生态制剂中应用最广且最具发展潜力的是耐氧双歧杆菌。

将微生物暴露于亚致死剂量的应激或逐渐增加应激剂量能够使细胞产生适应反应，进而更好地抵制致死剂量的应激。部分双歧杆菌具有一定的耐氧力，较易进行耐氧驯化。驯育过程中，由于接触氧而诱导双歧杆菌产生诱导酶H2O2酶，能够解除对双歧杆菌的毒害作用，通过驯育厌氧就可获得耐氧菌株。

国内外有大量进行双歧杆菌耐氧驯化的研究，使用不同基质进行的双歧杆菌耐氧驯化都有涉及。Talwalkar［18］第一次进行了双歧杆菌对氧气敏感度的定量检测，使用了一种相对细菌生长率(RBGR)方法，RBGR是需氧生长和厌氧生长的比率，提供了一个数值上的指标。Talwalkar和 Kailasapathy［19］使用酸奶作为基质，通过泵入纯氧，来逐渐增加基质中溶氧量，进而逐级适应双歧杆菌，最终获得的适应细胞能够抵制高浓度溶解氧破坏作用，其在溶氧量为210mL/L的酸奶中贮存35 d，活菌数仍没有降低。

氧适应能够提高双歧杆菌的的耐氧性，进而避免其在益生菌制品的加工、包装、贮藏和摄入过程中失活。该方法廉价、经济，是一种很有发展前景的方法。

3.2 抗氧化剂进行去氧胁迫

利用抗氧化剂来消除培养基中的氧气，可以解除氧气对于代谢过程的抑制作用。糖酵解过程中，果糖-6-磷酸解酮酶(F6PPK)为一个重要的限速酶，由于氧气可以经过氧化氢氧化酶的作用转变成H2O2，培养基中氧含量的增加导致H2O2逐渐积累，菌体自身不能解毒，对F6PPK产生毒害作用，抑制了F6PPK发挥作用，最终导致代谢过程中糖酵解作用被抑制，以至于影响了双歧杆菌的生长［20］。

氧化还原电位对双歧杆菌的生存有明显影响。当双歧杆菌生长的环境中存在分子氧时，会提高环境的氧化还原电位，从而毒害菌体。如果发酵液中存在还原性物质，可以使发酵液保持较低的氧化还原电位，或与氧发生化学反应消耗发酵液中残留的氧，有利于专性厌氧微生物繁殖，从而增加双歧杆菌制品中的活菌数。Zhao［21］选用动物双歧杆菌和婴儿双歧杆菌，通过在脱脂乳培养基中加入抗坏血酸钠、半胱氨酸等，双歧杆菌的活菌数增加了150%～190%，该方法可简单而有效地高密度培养双歧杆菌。

3.3 制作微胶囊

微胶囊化的双歧杆菌可以抵抗高浓度的氧气，保证制剂在生产和贮藏过程中的高活菌数;并在通过胃、肠环境时获得一定的抵御胃酸、胆汁、消化酶的能力［22］，最后能以很高的活菌数定植于肠黏膜上。

制作微胶囊的过程是一个将细胞放在胶囊膜内部免受损伤和细胞死亡的过程［23］，这种胶囊基质对细胞的封装能够将细胞与有害因子(如O2)直接分离开，同时还能允许营养物质溶液进出基质，保持合适水分活度，最终使活菌含量增加，提高和延长双歧杆菌和活菌的保存期、改变双歧杆菌剂产品的形态、提高产品的稳定性，以此发挥其生理保健功能。

3.4 双歧杆菌厌氧特性的基因调控

从遗传和生化角度看，厌氧菌或兼性厌氧菌SOD基因活性很小，只在有氧的环境下，通过诱导作用，SOD酶活性才显示出来。若通过生物工程手段改变超氧化物歧化酶的调控基因则可能提高双歧杆菌耐氧活性。而且将外源的SOD基因和CAT基因转入厌氧菌中，还能提高厌氧菌对氧的抵抗能力。

质粒能够编码各种重要的特殊性质，并且已经成为双歧杆菌遗传学研究及基因工程菌株构建的重要部分，含有质粒载体的双歧杆菌能够获得质粒编码的许多自身没有的性状。目前构建的双歧杆菌载体以大肠杆菌－双歧杆菌穿梭质粒为主，选择载体后，在其基础上插入双歧杆菌功能性基因、复制子基因、选择性标记(食品级标记)等片段，构建出克隆载体和表达载体［24］。

根据上述双歧杆菌厌氧机理及基因工程手段，可以对双歧杆菌的厌氧特性进行改造，提高其对氧的耐受性，从而显著改善双歧杆菌在食品中的存活率和稳定性。大致路线为:筛选食品级双歧杆菌，提取质粒、构建表达载体，将克隆到的CAT和SOD等耐氧有关的基因与载体连接，转化到双歧杆菌使其表达。基因工程双歧杆菌以其独特的功能特性在食品工业、医药行业中能够获得广泛的应用。

此外，还可以借鉴其他厌氧菌内部的抵抗氧化应激的机制。通过基因工程的方法改造双歧杆菌，使双歧杆菌内部形成一个降解氧气的网络，这对改善其耐氧性有重要意义。严格厌氧细菌丙酮丁酸梭菌的氧化应激反应中非血红素蛋白 (revRbr)的表达量上调，其中的NROR(NADH:红素氧还蛋白氧化还原酶)、Rd(红素氧还蛋白)也都与抗氧化应激有关［25］。厌氧菌脱硫弧菌有很好的氧气代谢途径［26］(图1)。

3.5 其他改善方法

图1 脱硫弧菌降解氧气的途径

吕兵利用原生质体融合技术将专性厌氧的短双歧杆菌和啤酒酵母进行原生质体细胞融合，成功初筛出兼具两亲本生物学性状、较稳定的融合子BSFI和BSF2，改善了双歧杆菌的耐氧性。

对于双歧杆菌制品(如酸奶)，可利用高耗氧的菌株来解除基质中氧气对于双歧杆菌的抑制作用［27］。嗜酸乳杆菌的代谢活动要依靠氧气来进行，通过嗜酸乳杆菌来清除酸奶中溶解氧，从而帮助双歧杆菌来生长。

利用低氧渗透性包装材料是很重要的方法，通常用的聚乙烯和聚苯乙烯都对氧气有一定渗透，阻止氧气渗透的包装材料能够增加包装内双歧杆菌的活菌数。Miller等［28］提出了一种相对便宜而且不渗透氧气的包装材料，在聚苯乙烯基础上加一层隔绝气体的NupakTM，储存过程中该包装材料的内部溶氧量没有增加。

4 双歧杆菌制品的应用前景

双歧杆菌制品是利用宿主自身的优势生理细菌——双歧杆菌作发酵剂，通过工业化发酵扩大生产制成活菌制剂，再回归宿主原来的生境，达到调节或维持机体正常生理状态的制品。

目前市场上有关双歧杆菌的商品根据其机能可分为双歧杆菌食品、含有双歧杆菌及其生长促进物质的特定保健性食品和双歧杆菌药品。

通过了解双歧杆菌的耐氧机制及研究双歧杆菌的耐氧能力、利用各种手段改善双歧杆菌的耐氧性能够扩大双歧杆菌的研究应用范围。未来的研究将集中在如何通过各种手段锻炼菌体，使其适应在工艺操作中不利于生存的理化环境下保持存活的数量和质量;如何提供足量的活菌以便充分发挥其生理功能等方面。

选择一个好的益生菌的标准之一是货架期的耐受性和稳定性。逐步增加氧气的浓度能够使细胞逐渐适应高氧气胁迫，同时注意菌种的氧化研究对于食品系统的实践。选育耐氧性能良好的菌株，或者利用基因工程手段得到高耐氧的菌株，可以大大扩展双歧杆菌的使用范围。如与其他乳酸菌联菌株发酵产品;配合一些双歧因子能够生产出具有多种功效的制品;除用于食品医药外，双歧杆菌还可应用于畜牧业;双歧杆菌是一种广泛分布于温血动物肠道的有益菌，可利用该类菌来促进畜禽的健康生长和延长蜜蜂的寿命;含有高活菌数酸奶的生产等。

5 展望

双歧杆菌的生存及氧气毒害是“古老”又“新颖”的话题，如何能够更好地运输含有活菌数高的产品及获得更长的货架期还是至关重要的。目前对于双歧杆菌耐氧性的研究大多数是关于氧引起的细胞水平的研究，从分子水平去阐明氧气引起的变化以及在氧胁迫时的胁迫蛋白的研究还是较少。有关氧气与双歧杆菌的相互作用的研究比较欠缺，氧气对双歧杆菌毒害作用的机制不太透彻，不能在操作上给出实际的指导意义。已经发现某些氧胁迫引起了蛋白质变化，从这个方向去研究也许能够为双歧杆菌的生化代谢途径和促进氧应激适应有很大的帮助。如何通过分子手段筛选和重组成新的具有高耐氧性的双歧杆菌成为其在工业化生产中应用的关键。

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Research and Application on the Oxygen Tolerance of Bifidobacteria

Zhao Jian-yun，Zuo Fang-lei，Xiao Man，Chen Shang-wu
(Laboratory of Function Dairy Ministry of Education and Beijing City College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China)

Bifidobacteria are functional Probiotics，which are commonly useful to the health of organisms.Bifidobacteria have been studied widely in microbial realm，food field and medical community due to their unique functions.Bifidobactria are oxygen-sensitive bacteria，they can’t convert reactive oxygen into nontoxic molecules，thus their research and application are restricted.In the future，the oxygen tolerance of Bifidobacteria will become more and more important.The oxygen tolerance and its mechanism，the methods to improve oxygen tolerance，the prospect of the Bifidobacteria products with high oxygen tolerance were reviewed in this paper aimed to provide references for future research.

Bifidobacteria，Oxygen tolerance，Oxygen mechanism，Oxidation stress

硕士研究生。

*国家高技术研究发展计划(863)支持项目(项目编号:2008AA10Z310)国家自然科学基金(项目编号:31071507)

2010－08－16，改回日期:2010－09－13