电容法在线活细胞量传感器在黑曲霉带渣发酵生产柠檬酸中的应用*

刘玉伟，黄明志，周勇，张继学，杨儒文，冯志菲，常雷，赵亲虎

1(国家生化工程技术研究中心(上海)，上海，200237)2(安徽丰原生物化学股份有限公司，安徽蚌埠，233010)

电容法在线活细胞量传感器在黑曲霉带渣发酵生产柠檬酸中的应用*

刘玉伟1，黄明志1，周勇2，张继学2，杨儒文2，冯志菲2，常雷2，赵亲虎2

1(国家生化工程技术研究中心(上海)，上海，200237)2(安徽丰原生物化学股份有限公司，安徽蚌埠，233010)

以黑曲霉带渣发酵生产柠檬酸的培养过程为对象，探讨了用电容法在线活细胞量传感器测量复合培养基中可结团丝状菌的活细胞量的可能性。通过实验确定了仪器的最佳分析条件:低通滤波值为60，测定频率为双频(580，10 085 kHz)。实验结果表明，电容法活细胞量传感器的电容值与活细胞量之间有着较好的线性对应关系，其线性相关系数为0.994。在发酵培养液采用带渣发酵的情况下，考察了在线活细胞电容值与常规的离线测定菌浓方法，如细胞干重、波长600nm处吸光度OD600和菌体离心体积之间的关系结果表明，在0～20 h，各离线参数与电容值之间的线性相关系数最好的仅为0.91。同时利用在线活细胞传感器的电容值能较好地估计出比生长速率，比通过在线间接参数OUR、CER估计更准确。因此，电容传感器为黑曲酶带渣发酵提供了一个可靠的工具。

在线活细胞量传感器，电容值，黑曲霉，复合培养基，带渣发酵

大量活细胞的存在是生物过程得以持续进行的前提条件，长期以来人们一直试图检测生物过程中细胞的浓度，以了解细胞生长状况，考察细胞生长与基质消耗及产物形成的关系。传统的测量方法是通过手工取样离线测定，比如测定干重(DCW)、吸光度(OD600)和离心体积(PMV)等。这些离线测定方法操作复杂，滞后时间长，测定结果是“活”细胞和“死”细胞的总和。常用的基于比浊法的细胞浓度传感器尽管可在线检测细胞浓度，但也存在诸多不足，如无法克服培养基中固体成分的干扰，无法区分死细胞和活细胞，容易受细胞大小影响等，在实际应用中存在较大误差。为了解决这些问题，近年来提出了多个基于不同测定原理的在线细胞量测量方法，如近红外光谱法［1］、电阻光谱法［2］和电容法是［3］，其中电容法根据活细胞具有密闭的细胞膜系统的特点，在交变电场作用下活细胞内带电细胞质迁移，使活细胞成为极化细胞，形成电容，根据测得的电容大小可计算出活细胞的量。基于电容法的活细胞量测量已在多个生物过程中得到成功应用，如酵母菌［4－5］、链霉菌［6］和CHO［7］等。柠檬酸发酵过程中产物的形成与黑曲霉菌细胞的生长密切相关，活细胞量的精确测量非常重要，但由于培养基中水不溶性物质的存在，长期以来这个问题一直难以解决，尚未见到可在线测量柠檬酸发酵过程中活细胞量的报道。本论文将基于原生质电容法的在线活细胞量传感器应用到柠檬酸发酵过程中，探讨带渣发酵过程中活细胞量的测定方法。

1 材料与方法

1.1 菌种

黑曲霉(Aspergillus niger)C0827，安徽丰原生化提供。

1.2 培养基和发酵条件

1.2.1 培养基

种子培养基:玉米粉15%，pH值5.8(用Ca(OH)2调制)。发酵培养基:玉米粉25%，尿素0.02%，pH 5.6～5.8(用Ca(OH)2调)。

1.2.2 培养条件

种子罐培养条件:温度36℃，通气量1.2VVM，罐压0.07 MPa，搅拌转速350 r/min。

发酵罐培养条件:温度37℃，通气量1.1VVM，罐压0.07 MPa，搅拌转速350 r/min。

1.3 离线参数分析方法

干重测量:通过将40mL的发酵液用滤纸进行过滤，再用清水清洗2次，直至洗掉发酵液中的残糖，然后将滤纸连同固体一起放到80℃烘箱中烘至恒重。

OD600测量:通过发酵过程中取得的发酵液经适当倍数稀释后在波长600 nm下的吸光值。

PMV测量:通过将10mL的发酵液用10mL离心管离心，测定离心后固体体积的百分数。

柠檬酸的测定:用0.142 9mol/L NaOH溶液中和滴定(酚酞指示剂)。

总糖的测定:采用菲林试剂法。

1.4 在线参数分析

活细胞量分析:采用Biomass Monitor 220(Aber，UK)检测发酵过程中活细胞浓度。将电极插到30L发酵罐中，121℃灭菌消毒后，电容和电导可同时被测量出来。该仪器能够采用多频率测量，测量的电容范围在0.1～10 MHz，电导范围为1～100 ms/cm。测量原理为通过探头发射电脉冲信号，在探头周围形成一个电磁场。活细胞有一个紧凑闭合的细胞膜，在电磁场下可被看作独立的小电容器。在电磁场作用下，活细胞被极化，细胞膜周围的电荷上升，这个电容变化值被准确检测出来，而死细胞(细胞膜破裂)、气泡、细胞碎片以及固体培养基颗粒(如玉米粉/黄豆饼粉等)或微载体颗粒等因不能形成密闭的电容，不会被检测到，因此电容电极测得的信号值只与发酵罐中活细胞量的值有一定的相关性。

气体成分分析:发酵过程进气和排气中O2和CO2浓度通过过程质谱仪MAX-300 LG(Extrel，USA)获得，将所获得的在线尾气数据通过生物过程软件“发酵之星”(华东理工大学)进行处理，在线计算出O2消耗速率OUR，CO2释放速率CER和呼吸商RQ。

2 结果和讨论

2.1 分析条件优化

电容法在线活细胞传感器在黑曲霉菌带渣发酵过程的使用还未见报道，需要考察外部条件对仪器性能的影响，特别是低通滤波值和测量频率对基线噪声和漂移性能的影响，以确定仪器的最佳使用条件。按照仪器的使用说明，将低通滤波值设为1，把发酵罐搅拌和通风开到最小或关掉，观察此时的电容基线和噪音大小，然后根据观察到的基线噪声，将低通滤波值大小设定为10，如果信号噪音强度还是大，那么就需要继续增大低通滤波值，直到噪音强度合适。低通滤波值可在1～100之间设定，过大和过小的低通滤波值都不能得到稳定的测量结果。考虑到柠檬酸发酵用培养基的水不溶性物质较多以及通风量较大，可能会造成较大的基线噪声，因此分别把低通滤波值设为30、45和60，观察测定结果，发现低通滤波值为60时能取得较好的效果。同时，测量频率设定为多频或者低频，会对测定结果产生较大的影响。在低通滤波值固定为60的情况下，考察了测量频率对仪器的影响，分别将频率设为单频580 kHz以及双频580 kHz和10 085 kHz。单频测量时不考虑背景电容的影响，而双频的高频率测量值相当于培养基的背景电容，仪器能自动地从低频率电容减去高频率电容。发酵过程中仪器在优化前(单频)和优化后(双频)的测量曲线如图1所示。从图1可看出，用单频测量电容曲线上下波动幅度较大，无法正确判断细胞的变化情况，而用双频测量的曲线变化平缓，能够很好地反映发酵过程中黑曲霉菌的菌团个体增大的过程。因此，对于黑曲霉带渣发酵，最优的测定条件为低通滤波值为60，频率为双频580 kHz和10 085 kHz。

图1 黑曲霉菌带渣发酵传感器最优条件

2.2 电容值与活细胞量之间的对应关系

要得到活细胞传感器测量出的电容值与活细胞量之间的对应关系，首先要知道活细胞量的确切值，但对于黑曲霉这种在发酵过程中会结团的细胞来说，常用的菌落计数和血小板计数等方法都不能使用，尚没有其他办法能直接测出活细胞的量，为此，本文设计实验将玉米粉进行液化后过滤，除去玉米渣，把黑曲霉接种在过滤清液中进行培养，在4～20 h的对数生长期内分别取样，离线测量细胞干重，结果如表1所示。对数生长期内的细胞活力旺盛，可看作都是活细胞，而且发酵液中不含有其他固体颗粒，因此，此时的细胞干重大小可直接反映活细胞量的多少。将离线测量的细胞干重与在线检测的电容值进行线性回归，得到方程1，其相关系数为0.994。可见在考察的范围内，活细胞传感器测量出的电容值能准确地反应发酵过程中活细胞量的变化。

表1 培养基为过滤清液时菌体干重与电容的关系

2.3 电容值与各种离线测定值之间的比较

为了探讨黑曲霉菌带渣发酵中活细胞量的最佳测量方法，比较了电容在线测定法与3种离线测定方法，结果如图2所示。尽管所有的离线测定方法目前都被广泛使用，但是它们都各有缺点。OD、PMV、干重(DCW)通常用来估计总的菌体浓度，PMV法，因为它的简单易于操作，在医药领域被广泛用于菌体浓度的测量，然而培养基配方和细胞形态的改变，使这种测定方法变得不可靠。细胞干重在一定条件下能很好地反映细胞量，但在一些发酵过程中有的发酵液组分会粘附在细胞表面，即使用去离子水冲洗也不能完全洗掉，导致测量出的细胞干重比实际的细胞量要大，同时，柠檬酸发酵培养基中含有玉米渣，取样时玉米渣并没有完全被菌体利用，因此离线测定的细胞干重包含了没有被菌体利用的渣子以及死的细胞。而电容在线测定法中，电容值只与活细胞量有关，与玉米渣的多少没有关系，死的细胞对电容值也没有影响，是最可靠、最有效的活细胞量测定方法。对各种离线测定值与在线电容之间的关系进行了拟合，它们都没有很好的线性关系，线性最好的PMV与在线电容间的线性相关系数也仅为0.91。如果仪器的稳定性不高，每一次测量的电容结果有较大差异，则很难解释发酵过程的现象。为此，考察了活细胞量传感器在不同批次发酵过程中测量结果的重复性。在相同的菌种、培养基组成及操作条件下，比较了3批发酵过程中记录的电容测量值，它们之间具有较好的重复性(见图2)，因此该传感器能够为黑曲霉带渣发酵生产柠檬酸过程提供稳定可靠的活细胞量信息。

图2 在线电容法与各种离线测定菌浓法的比较

2.4 比生长速率在线估计

比生长速率的控制在发酵过程中有着重要的意义，很多种微生物只有在一定的比生长速率下才能高效生产出特定产物，但由于细胞量在线测定技术的不完善，目前比生长速率大多根据离线菌体浓度进行计算，滞后时间长，很难实际应用。本文尝试运用在线电容值来进行比生长速率的在线估计，比较了其与基于过程质谱仪测定的尾气数据计算出的OUR和CER进行估计的方法的优劣。

基于电容测定值的比生长速率可通过式(2)计算:

式中a为菌浓与电容之间的系数，为常数，可以消除。将Cap对t在半对数坐标上作图，直线的斜率即为μ。对批培养操作在半对数坐标上为一曲线，曲线某点的切线斜率即可近似为该点的μ值。同理，生物过程中OUR、CER和菌量存在一定的关系，OUR(CER)=X Q，假设活细胞的呼吸强度Q是一样的，那么OUR、CER和活细胞量之间也存在正比关系，比生长速率分别表示为式(3)和式(4)来计算。

在发酵过程中，分别基于电容、OUR和CER进行估计的比生长速率的变化如图4所示。，总体上来看，3种估计方法都能大体上反映出比生长速率由高到低的变化趋势，但从电容值估计出的比生长速率值可更真实地反映菌体的生长状态:在20 h之前，发酵过程处于对数生长期，比生长速率较大且波动平缓，20 h后，菌体生长处于稳定期，比生长速率维持在零左右。而从过程质谱仪测定的尾气数据计算出的OUR和CER进行估计的比生长速率的值变化较大，究其原因，尽管过程质谱仪分析的精度很高，计算出的OUR和CER的值的可信度也高，但由于不同代谢状态的细胞可能有着不同的呼吸强度，导致式(3)和式(4)的假设不能严格成立，从而引起了估算出来的比生长速率值的可信度降低。因此，从在线电容值估计的比生长速率可在今后的发酵过程在线控制中直接应用，可为发酵过程提出更精细的控制策略。

2.5 结合在线活细胞量的柠檬酸发酵过程参数分析

图5显示了黑曲霉带渣发酵过程参数的变化趋势，发酵罐接种后，几乎没有延迟期，很快进入了指数生长期，菌体利用葡萄糖作碳源，消耗 O2并放出CO2。随着菌体的生长，耗氧率增大，CO2释放率都明显地同步增加，到了6 h左右两者变化比较平缓，而后耗氧率保持平稳的增大，CO2释放率却下降很快，这是因为，此时菌体生长过程中释放的CO2进行羧化形成草酰乙酸进而合成柠檬酸，此时柠檬酸合成较快。16 h后菌体达到稳定期，耗氧率和CO2放率变化不大，都趋于平稳，呼吸商也稳定。到了54 h以后，菌活力下降，电容值呈下降趋势，耗氧率也随之降低，CO2释放率增大，导致RQ的陡升。说明这时菌体活力下降，引起耗氧率降低，发酵过程中形成的CO2不再进行羧化而被大量释放出来，造成途径的变化。与此同时，随着菌体的增加，残糖量将呈下降趋势。产酸在4 h之前变化不大，在细胞生长趋于稳定期时，开始进行羧化，酸度增加速率大。在整个发酵过程中，在线电容值很好地描述了活细胞量的变化，为菌体生长控制和产物合成优化提供了条件。

图3 用电容法、OUR和CER估计的比生长速率

图4 黑曲霉发酵过程各种参数的变化

3 结论

本文以黑曲霉带渣发酵生产柠檬酸的培养过程为对象，探讨了用电容法在线活细胞量传感器来解决这个难题的可能性。通过对仪器的分析条件进行优化，使其能够不受培养基中水不溶性物质的影响。实验结果表明，电容法活细胞量传感器的电容值与活细胞量之间有着较好的线性对应关系，在相同实验条件下数据的重复性较好。在比生长速率的估计中，在线电容法能准确地描述细胞生长状态的变化。综上所述，电容法在线活细胞量传感器能够准确测量出复合培养基中黑曲霉等可结团丝状菌活细胞量，了解这类菌体的细胞生长代谢情况，从而为对其实施控制提供了较好的检测手段。

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Study on Online Capacitance Viable-Cell Mass Monitoring in Citric Acid Fermentation by Aspergillus niger in Complex Medium with Corn Dregs

Liu Yu-wei1，Huang Ming-zhi1，Zhou Yong2，Zhang Ji-xue2，Yang Ru-wen2，Feng Zhi-fei2，Chang Lei2，Zhao Qin-hu2
1(National Engineering Research Center for Biotechnology(Shanghai)，Shanghai 200237，China)2(Anhui BBCA Biochemical Co.Ltd，Bengbu 233010，China)

In this paper，cultivations of Aspergillus niger grown on an complex medium with corn dregs were performed.The feasibility of measuring online capacitance viable-cell mass of Fila-fungus grown on a complex medium was discussed.This study confirmed that the best measurement conditions were doubled frequency of 580 kHZ，10085 kHZ and low pass filter of 60.The result proved the relationship between capacitance and viable-cell mass with a correlation coefficient(R2)of 0.993 8.While complex medium with corn dregs was adopted，conventional off-line biomass determinations of several parameters，including DCW，optical density at 600nm wavelength(OD600)，packed mycelial volume(PMV)were performed throughout the bioprocess and then compared with on-line viable-cell concentrations measured using a capacitance probe.As a result，the best correlation coefficient(R2)is 0.907 2.During the same time frame，we compared the results determined by on-line indirect estimation methods including oxygen uptake rate(OUR)and carbon dioxide evolution rate(CER)，and reached at the conclusion that the specific growth rates estimated by on-line capacitance measurement could be more reliable during citric acid fermentation.Therefore，it is concluded that a capacitance probe is a practical tool for real-time viable biomass monitoring in a complex medium with corn dregs.

on-line viable-cell mass sensor，capacitance，Aspergillus niger，complex medium，corn dregs

硕士。

*国家“863”项目(2006AA02Z204)

2010－05－26，改回日期:2010－08－18