顶空固相微萃取气质联用测定蒜油挥发性成分

陶宁萍,杨 柳

(上海海洋大学食品学院,上海 201306)

顶空固相微萃取气质联用测定蒜油挥发性成分

陶宁萍,杨 柳

(上海海洋大学食品学院,上海 201306)

以蒜油挥发性成分的总峰面积及总峰面积与峰数的比值为评价指标,比较了不同萃取头、吸附温度、吸附时间及解吸时间对固相微萃取的萃取效率的影响,得到最佳萃取条件：85μm PA萃取头、吸附温度 40℃、吸附时间 35min、解吸时间 3min,结果表明：固相微萃取技术有效地吸附了蒜油中的挥发性成分,经N IST质谱数据库检索和文献对照,共确定 27种成分,并且不需溶剂,分析简单、快速、经济。

顶空固相微萃取气质联用,挥发性成分,蒜油,超临界 CO2萃取

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜大蒜 产地上海,购于上海新芦苑集贸市场。

超临界二氧化碳萃取仪 Spe-ed SFE,美国Applied Separations公司;固相微萃取装置 手动进样手柄、萃取头 (100μmPDMS;85μmPA;85μm CAR/PDMS;75μm CAR/PDMS;65μm PDMS/DVB),美国 Supelco公司;气质联用仪 Trace MS,美国Agilent质谱公司;集热式恒温加热磁力搅拌器DF-101S,巩义市予华仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的制备 采用超临界流体萃取技术(Supercritical Fluid Extraction,SFE)制备蒜油,步骤如下：称取经粉碎的新鲜蒜泥 30.00g,装入超临界萃取釜中。在温度 40℃、压力 15MPa、静态循环 30min和动态萃取 90min的条件下进行萃取,收集得到浅黄色的蒜油提取物,有浓郁的蒜味。

1.2.2 萃取头的老化 按照 Supelco公司推荐的条件,将 85μm PA萃取头于 280℃下老化 1h;100μm PDMS萃取头于 250℃下老化 0.5h;75μm和 85μm CAR/PDMS萃取头于 300℃下老化 1h;65μm PDMS/ DVB萃取头于 250℃下老化 0.5h,老化至无干扰峰出现。

1.2.3 顶空固相微萃取萃取条件的优化 取 3mL蒜油提取物,置于含有微型搅拌子的 15mL棕色顶空瓶中。平衡 30min后,调节电热磁力搅拌器温度至所需温度,待温度恒定后,设定转速 800r/min,将样品置于磁力搅拌台上。将 SP ME针管插入顶空瓶的硅橡胶瓶垫,调整并固定萃取头顶空体积中的位置,伸出纤维头。待吸附完毕,缩回纤维头,抽出针头。将萃取头抽出插入 GC-MS联用仪,于 250℃解吸,进行GC-MS检测分析。

固相微萃取过程中影响萃取效果的因素有很多,包括萃取头的种类、吸附温度、吸附时间和解析时间等。实验以总峰面积及总峰面积与峰数的比值作为指标,来考察各因素对于顶空固相微萃取效果的影响,按表 1所列出的实验条件进行单因素实验。

表1 单因素实验条件

1.2.4 GC-MS测定 色谱柱：DB-35弹性毛细管柱(30m×0.25mm ×0.25μm);程序升温,起始温度40℃,保持 3min,然后以 10℃/min的升温速度升温到 50℃,再以 4℃/min的升温速度升温到 120℃,最后以 12℃/min的升温速度升温到 240℃,保持 5min;载气为 He,流量 0.8mL/min;汽化室温度 250℃。

质谱条件：电子轰击 (EI)离子源;电子能量70eV,灯丝发射电流为 200μA,离子源温度为 200℃,接口温度 250℃,检测器电压 350V。

1.2.5 定性定量方法

1.2.5.1 定性 实验数据处理由 Xcalibur软件系统完成。挥发性成分通过 N IST和W iley谱库确认定性,仅报道匹配度大于 800(最大值为 1000)的鉴定结果。

1.2.5.2 定量 按峰面积归一化法计算相对百分含量。

2 结果与讨论

2.1 萃取头的选择

萃取头是固相微萃取的关键部分。不同的纤维头涂层种类和厚度对目标化合物的吸附萃取能力是不同的,而萃取头的选择取决于目标化合物的极性、沸点和分配系数等参数。实验中采用 100μm PDMS、 65μm PDMS/DVB、85μm PA以及 75μm和 85μm CAR/PDMS五种不同涂层种类和厚度的纤维头,在吸附温度 30℃,吸附时间 30min以及解吸时间 5min下进行实验,实验结果如表 2、表 3所示。

不同萃取头吸附蒜油的挥发性成分的总离子流图如图 1所示,各成分及其峰面积如表 2所示。

图 1 不同萃取纤维头吸附挥发性成分的GC-MS总离子流三维图

从表 2看出,共 38种成分被检测出,其中有 16种链状含硫成分,10种环状含硫成分及 12种非含硫成分。从表 3看出,五种萃取头中吸附挥发性成分数目最多的是 85μm CAR/PDMS,其次是 75μm CAR/PDMS和 65μm PDMS-DVB。但从对蒜油挥发性成分的总吸附量来说,85μm PA显示出良好的吸附能力,灵敏度最高,吸附量最大,其次为 65μm PDMS-DVB和 85μm CAR/PDMS。国内外研究均表明,大蒜所具有的诸多生物活性功能都归因于其中的含硫成分。而85μm PA对蒜油中的含硫成分也表现出良好的吸附效果,吸附总量是五种萃取头中最大的。

此外,本实验选取了具有相同纤维涂层,但涂层厚度不同的 75、85μm CAR/PDMS。结果显示：相较于75μm CAR/PDMS,85μm CAR/PDMS吸附的挥发性成分的数目更多且吸附量更大,显示出对样品更高的灵敏度。这一结果也与纤维涂层越厚,固相吸附量越大,灵敏度越高相一致。

综合考虑对蒜油挥发性成分的总吸附量及其中重要的含硫成分的总吸附量,故选择对两者均有高灵敏度的 85μm PA进行后续实验。

2.2 萃取条件的单因素实验

图2 温度对萃取效率的影响

2.2.1 吸附温度的影响 从图 2看出,在 40℃之前,总峰面积随吸附温度的升高而增加。但在 40℃之后,总峰面积趋于平稳。在 30～35℃时,总峰面积与峰数的比值有一个轻微的下降过程,在 35～40℃,其数值又急剧地上升,在 40℃后,慢慢趋于稳定。经单因素方差分析,发现吸附温度 30℃的总峰面积及总峰面积与峰数比值与 35℃的无显著差异 (P＞0.05),但与 40℃的存在极显著差异 (P＜0.01)。而 40℃的总峰面积及总峰面积与峰数比值与 45～50℃区间的差异不显著 (P＞0.05)。考虑到蒜油中大部分成分不稳定,萃取温度不宜太高。因此,确定 40℃为最佳提取温度。

表2 不同纤维头对峰面积的影响

表 3 不同纤维头对挥发性成分的影响

2.2.2 吸附时间的影响 从图3可看出,在吸附时间10～35min时,随着吸附时间的延长,总峰面积及总峰面积与峰数比值呈上升趋势,纤维头的吸附量明显增加。经过单因素方差分析,在 10～35min时,总峰面积变化极显著 (P＜0.01),而总峰面积与峰数比值变化显著(P＜0.05)。但在 35min后,总峰面积及总峰面积与峰数比值差异不显著 (P＞0.05),两者的数值均基本趋于稳定,说明萃取头在 35min时已基本吸附饱和。在纤维头吸附饱和的状态下,再增加吸附时间,吸附量增加有限,意义不大,故选择 35min为最佳吸附时间。

表 4 超临界萃取蒜油的挥发性成分的分析结果

图3 吸附时间对萃取效率的影响

2.2.3 解吸时间的选择 从图 4可看出,在解吸1～2min时,总峰面积及总峰面积与峰数比值随着解吸时间的延长而增加,但在 2min后,两者的数值均增加缓慢,基本趋于稳定。对其进行单因素方差分析,发现解吸时间 1min的总峰面积及总峰面积与峰数比值与 2min的存在显著差(P＜0.05)。但 2min的总峰面积及总峰面积与峰数比值与 3、4、5min区间的差异不显著(P＞0.05),且两者的数值基本上在吸附 2min后基本保持不变。这说明萃取头在 250℃下解析 2min便能完全解析所吸附物质。为保证萃取头上的样品完全解吸掉,不对下次样品造成污染,且考虑到萃取头寿命,故确定 3min为最佳解吸时间。

图4 解吸时间对萃取效率的影响

2.3 超临界 CO2萃取蒜油挥发性成分的分析鉴定

选取 85μm PA萃取头,在吸附温度 40℃、吸附时间 35min和解吸时间 3min的条件下进行超临界CO2萃取蒜油挥发性成分的吸附测定,其总离子流图如图 5所示。经 N IST图库检索以及参考文献[6-8],共检出 27种成分,各成分及其相对含量如表4所示。

图5 超临界萃取蒜油的挥发性成分的 GC-MS总离子流图

从表 5中可以看出,超临界 CO2萃取的蒜油的挥发性成分主要以一些含硫化合物为主,也含有少量的酯类和醛类化合物。在检测出的 27种成分中,链状含硫成分有 13种、环状含硫成分 9种以及 5种非含硫成分,其中含硫成分总含量高达 98.91%,而这些含硫成分是大蒜的主要生物活性成分。Block[9]等人发现,二烯丙基二硫醚和三硫醚具有抗血小板凝集活性。Yogeshwer[10]等人研究发现,大蒜中的二烯丙基硫化物能有效抑制癌症的发展。

蒜油中的链状含硫成分如二甲基三硫醚(0.50%)、烯丙硫醇 (1.71%)、甲基-1-丙烯基二硫醚(1.15%)、二烯丙基硫醚 (0.51%)、二烯丙基二硫醚(6.57%)和二烯丙基三硫醚(11.42%)等都是大蒜特征性风味物质,具有浓郁大蒜香味。其中对蒜油风味有较大贡献的二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚是具有强烈的大蒜香气的物质,但没有催泪作用。此外,环状含硫成分中 2,4-二甲基噻吩、二噻烷等都具有大蒜和洋葱样的香气;非含硫成分中 2-丙烯醛(0.5%)具有强烈刺激性,有催泪作用,对风味有一定贡献[11-12]。

Athanasios[13]等认为,蒜素热分解生成烯丙基次磺酸和硫代丙烯醛,后者会进一步发生二聚反应形成 3-乙烯基-1,2-二硫杂-4-环己烯和 3-乙烯基-1,2-二硫杂-5-环己烯,因此这两种化合物的含量可作为活性物质蒜素含量的指标。从表 5中可以看出,使用超临界 CO2萃取的蒜油中,这两种成分的含量高达 58.81%。而周海滨[14]等人利用 GC-MS对超临界萃取的蒜素进行了研究,检测出两种成分的含量为 55.48%,说明使用顶空固相微萃取联合气质联用能有效地分析鉴定超临界 CO2萃取蒜油的挥发性成分。

此外,使用固相微萃取气质联用法分析超临界CO2萃取的蒜油,检测出环丁烯砜 (1.71%)和癸醛(0.06%)等成分,这一点在其它文献中未见报道。

3 结论

3.1 五种萃取头中吸附挥发性成分数目最多的是85μm CAR/PDMS,其次是 75μmCAR/PDMS和65μm PDMS-DVB。但从对蒜油挥发性成分的总吸附量和含硫成分的总吸附量来说,85μm PA显示出良好的吸附能力,灵敏度最高,吸附量最大。

3.2 实验确立顶空固相微萃取蒜油挥发性成分的最佳条件是：吸附温度40℃,吸附时间 35min,进样口温度250℃,解析3min。在此萃取条件下,HS-SP ME法可以很好地吸附蒜油样品的挥发性风味成分,通过GC-MS的分析检测,可以得到良好的总离子峰图。

3.3 超临界萃取蒜油中挥发性成分主要以挥发性含硫化合物为主,还含有少量的酯类和醇类化合物(见表 4)。在所测定的 27种成分中,其中链状含硫化合物 13种,环状含硫化合物 9种,非含硫化合物 5种,含量分别为 34.54%、64.37%和 1.09%。SP ME技术结合 GC-MS对超临界 CO2萃取蒜油的挥发性成分有较好的分析效果,且其具有操作方便、不需溶剂、成本低等优点,具有广泛的开拓前景。

[1]王锡昌,陈俊卿 .固相微萃取技术及其应用[J].上海水产大学学报,2004,13(4)：348-352.

[2]刘源,周光宏 .顶空固相微萃取气质联用检测鸭肉挥发性风味成分[J].江苏农业学报,2005,21(2)：131-136.

[3]江健,王锡昌 .顶空固相微萃取与 GC-MS联用法分析淡水鱼肉气味成分[J].现代食品科技,2006,22(2)：219-222.

[4]程劲松,王承明 .固相微萃取气相色谱测定酱油香味成分条件的优化[J].食品工业科技,2008,29(1)：69-71.

[5]左俊,滕建文 .顶空固相微萃取-气质联用技术分析芒果的芳香成分[J].食品科技,2008(5)：229-232.

[6]O Calvo-Gómez,J Morales-López.Solid-phase microextraction-gas chromatographic-mass spectrometric analysis of garlicoil obtained by hydrodistillation[J].Journal of ChromatographyA,2004,1036：91-93.

[7]罗兰,刘佳佳 .不同提取方法的大蒜挥发油 GC-MS比较分析[J].中成药,2008,30(1)：139-141.

[8]梁永海,李凤林 .不同方法萃取大蒜油生产工艺的研究及其成分的分析[J].中国粮油学报,2004,21(2)：69-71.

[9]Block E ,Ahmad S, et al.Antithrombotic organosulfur compounds from garlic：Structure,mechanistic,and synthetic studies[J].J Am Chem Soc,1986,108：7045-7055.

[10]Yogeshwer Shukla,Neetu Kalra.Cancer chemoprevention with garlic and its constituents[J].Cancer letters,2007,247：167-181.

[11]舒宏福 .新和成食用香料手册[M].北京：化学工业出版社,2004,8：317-337.

[12]孙宝国,刘玉平 .食用香料手册[M].北京：中国石化出版社,2004,8：400-413.

[13]Athanasios C,Kimbaris,et al.Comparison of distillation and ultrasound-assisted extraction methods for the isolation of sensitive aroma compounds from garlic(Allium sativum)[J]. Ultrasonics Sonochemistry,2006,13：54-60.

[14]周海滨,孙君社 .超临界 CO2萃取蒜素及其化学成分研究[J].食品科技,2003(9)：16-18.

Analysis of volatiles from garlic oil by headspace-solid phase m icroextraction-gas chrom atography-m ass spectrom etry

TAO Ning-ping,YANG L iu
(College of Food Science&Technology,ShanghaiOcean University,Shanghai 201306,China)

A m e thod for the de te rm ina tion of vola tiles from ga rlic oil us ing headsp ace solid p hase m ic roextrac tion (HS-SPM E)and gas chrom a tog rap hy-m ass sp ec trom e try(GC/MS)was p resented.By tota l p eak a rea and ra tio of tota lp eak a rea to num be r of p eaks used as the m a in eva lua ting indexes,the ana lys is p a ram e te rs of d iffe rent SPM E fibe rs,extrac tion t im e,extrac tion temp e ra ture,desorp tion t im e we re op t im ized.The op t im um extrac tion cond itions we re ob ta ined as follows：85μm PA fibe r,exp osure for35m in a t40℃,and desorp tion for3m in a t250℃. The results showed tha t SPM E was effec tive to ana lys is of the vola tiles in ga rlic oil,twenty-seven comp ounds we re identified.The m e thod is s imp le,quick,solventless and inexp ens ive.

headsp ace-solid p hase m ic roextrac tion-gas chrom a tog rap hy-m ass sp ec trom e try;vola tile;ga rlic oil; sup e rc ritica lCO2extrac tion

TS207.3

A

1002-0306(2010)03-0172-05

固相微萃取技术 (Solid Phase microextraction, SP ME)是一种新颖的集采样、萃取、浓缩、进样于一体的萃取浓缩技术,它具有无需有机溶剂、简单方便、快速、选择性好且灵敏度高等优点[1],因而已广泛用于食品挥发性风味成分的分析检测,如检测生熟鸭肉[2]、淡水鱼[3]、酱油[4]、芒果[5]等的风味成分。大蒜因具有诸多的药理作用,如抗菌、抗癌、抗氧化、提高机体免疫力以及降低血糖、血脂和血压等功能而日益受到人们的关注,各类大蒜产品也越来越受到消费者的青睐。而在众多的大蒜制品中,又以蒜油为主要形式之一。本工作首次使用顶空固相微萃取联合气质联用分析超临界 CO2萃取蒜油的挥发性成分,通过对萃取头种类、吸附温度、吸附时间和解析时间进行单因素实验,以确定各因素对萃取效果的影响程度,确立最佳萃取条件。并在该条件下对超临界 CO2提取蒜油进行定性分析,为进一步改善蒜油提取工艺和分离纯化提供理论基础,对开发大蒜深加工制品具有现实意义。

2009-05-21

陶宁萍 (1968-),女,博士,副教授,研究方向：食品营养与安全。