棕檬酸与胃蛋白酶协同水解牛骨粉的工艺优化

尹彦洋,罗爱平,＊,伍贤位,吴 敏

(1.贵州大学生命科学学院,贵州贵阳 550025; 2.铜仁职业技术学院,贵州铜仁 554300)

棕檬酸与胃蛋白酶协同水解牛骨粉的工艺优化

尹彦洋1,罗爱平1,＊,伍贤位1,吴 敏2

(1.贵州大学生命科学学院,贵州贵阳 550025; 2.铜仁职业技术学院,贵州铜仁 554300)

以新鲜牛骨为原料,探讨牛骨粉的制备工艺;采用对比和正交实验相结合的设计方案,用柠檬酸与胃蛋白酶协同水解牛骨粉,以水解度、钙溶出率为特征性指标,三氯乙酸中可溶性氮含量评定水解效果。结果表明:牛骨在 121℃, 0.14MPa条件下,蒸煮 120min全部松软,蛋白质暴露面积增加,有利于其水解;用柠檬酸水解牛骨粉,水解度与钙溶出率呈极显著相关性(P<0.01);柠檬酸与胃蛋白酶协同水解牛骨粉的最佳条件:柠檬酸浓度 0.5mol/L、酶与底物蛋白量比(E/S)为 500U/g、底物浓度 11%、反应时间为 6h,水解度与钙溶出率分别达 33.7%和 11.2%;三氯乙酸中可溶性氮含量达到 97.2%,表明大部分产物为低分子肽类,溶解性高。

牛骨粉,柠檬酸,胃蛋白酶,水解度,钙溶出率

牛骨约占胴体重的 20%～30%[1],是一种营养价值非常高的肉类加工副产品。骨骼中含有丰富的蛋白质,其中 90%为胶原、骨胶原及软骨素[2],具有增强皮下细胞代谢,延缓衰老的作用。骨蛋白是较为全价的可溶性蛋白质,生物学效价高[3]。据报道,骨粉中必需氨基酸含量为 5.518mg/100mg,占氨基酸总量的 20.67%[4]。柠檬酸为无色半透明晶体或白色结晶粉末,无臭、味极酸,易溶于水和乙醇,水溶液显酸性。其与骨粉溶液作用,通过与结合释放出H+,H+再与液体中、Ca2+等结合,骨粉中钙与液体中不断交换达到平衡,溶液呈酸性,磷酸钙大部分与 H+作用生成磷酸氢钙,可溶性钙含量增加[5];柠檬酸作用于蛋白质,主要破坏蛋白质中的盐键和酯键等副价键,使蛋白质二、三级结构受到破坏而变性分解,对于胶原蛋白,就是使胶原中邻近胶原蛋白的连接处分解[6]。柠檬酸在生物体内参与机体的新陈代谢,无毒副作用[7],并为胃蛋白酶提供酸性环境。胃蛋白酶是一种内切酶,其作用是切开蛋白质分子内部肽键,将蛋白质水解成分子量较小的多肽。利用柠檬酸与胃蛋白酶协同作用,探讨柠檬酸与胃蛋白酶水解牛骨粉的最佳工艺条件,可充分提高骨蛋白、骨钙的利用率,为开发骨蛋白、骨钙深加工产品提供理论依据和参数。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

胃蛋白酶 (Poreme gastric Mucosa) 酶活力144000U/g,购于 sigma公司;新鲜牛管骨﹑扁骨 购于贵阳花溪农贸市场;柠檬酸 重庆川江化学试剂厂,分析纯。

YX-28OB型蒸汽灭菌锅 上海三申医疗器械有限公司;F100高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司;PHS-SC型酸度计 上海康仪仪器有限公司;KDN-04A型凯氏定氮仪 上海昕瑞仪器仪表有限公司;THZ-98A恒温振荡培养箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 牛骨粉的制备工艺流程 新鲜牛骨→切割→清洗→加热熬煮去脂→高压蒸煮→去骨髓、骨油→风干→粗粉碎→细粉碎→过筛

1.2.2 操作要点

1.2.2.1 切割 用切割机将牛骨切成 4～5cm的骨块。

1.2.2.2 清洗去杂 清水洗净牛骨,剔除筋、腱等非骨成分。

1.2.2.3 脱脂 牛骨块置于锅中,以蒸馏水刚好浸没为宜,微沸 1h,除去残血,取出脱脂。

1.2.2.4 蒸煮 0.14MPa分别蒸煮 60、90、120、150min,观察骨骼软化程度,计算原料损失率。

1.2.2.5 风干 60～70℃恒温干燥 4～6h。

1.2.2.6 粗粉碎 将干燥后的骨块进一步粗粉碎为1cm左右的小块,再进行细粉碎。

1.2.2.7 细粉碎 过 160目筛。分别测定蛋白质、钙、及含水率。

1.2.3 柠檬酸水解牛骨粉设计方案 采用单因素对比实验方案,分别设实验组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。以0.5mol/L柠檬酸溶液对牛骨粉进行处理,使牛骨粉悬液浓度为 9%,121℃高温加热处理 30min,水解温度 37℃,时间 5h,酶量与底物蛋白量比(E/S)300U/g水解牛骨粉。以水解度和钙溶出率为评定指标,实验设计如下:

实验组Ⅰ:不采用高温加热处理;实验组Ⅱ:以蒸馏水代替柠檬酸溶液处理牛骨粉,使其浓度为9%,高温处理后,添加柠檬酸,使其浓度达 0.5mol/L;实验组Ⅲ:分别以柠檬酸浓度为 0.125、0.25、0.5、1、1.5mol/L处理牛骨粉;实验组 Ⅳ:分别在 70、80、90、100、121℃温度下加热处理 30min;实验组 Ⅴ:121℃高温加热处理时间分别为 10、20、30、40、50min。

1.2.4 胃蛋白酶水解牛骨粉设计方案 分别固定酶解温度 37℃、底物浓度 9%、酶量与底物蛋白量比(E/S)为 300U/g、水解 5h。以水解度为指标,采用单因素实验确定牛骨蛋白的水解条件。

1.2.4.1 酶解温度的确定 在酶解温度为 20、25、32、37、42、47℃条件下水解,确定最适酶解温度。

1.2.4.2 底物浓度的确定 在底物浓度为 3%、5%、7%、9%、11%、13%条件下水解,确定最适底物浓度。

1.2.4.3 E/S的确定 在 E/S为 100、200、300、400、500、600U/g条件下水解,确定最佳 E/S。

1.2.4.4 酶解时间的确定在酶解时间为 2、3、4、5、6、7h条件下水解,确定最佳酶解时间。

1.2.5 测定指标

1.2.5.1 水分 按 GB/T5009.3—2003测定,直接干燥法。

1.2.5.2 脂肪 按 GB/T5009.6-2003测定,索式提取法。

1.2.5.3 钙溶出率的测定 钙含量测定:按 GB/T 9695.13-1988测定,高锰酸钾法。

钙溶出率(%)=酸与酶解液中钙含量/牛骨粉中钙含量 ×100%[8]

1.2.5.4 蛋白质、水解液总氮量测定 按 GB/T 5009.5-2003测定,凯氏定氮法。

1.2.5.5 游离氨基态氮测定 按 GB/T 12143.2-1989测定,甲醛电位滴定法。

1.2.5.6 水解度[9]水解度DH(%)=酸与酶解液中游离氨基酸态氮/酸与酶解液中总氮量 ×100%

1.2.5.7 原料损失率 损失率 (%)=[牛骨蒸煮前的重量 (g)-牛骨高温高压蒸煮后的重量 (g)]/牛骨蒸煮前的重量(g)×100%

1.2.5.8 三氯乙酸中可溶性氮 (TCA-NSI)含量[10]将20mL 20%三氯乙酸(TCA)溶液加到20mL酸与酶解液中,混合振荡,静置 60min后于 4000r/min离心20min,取上清液测定总氮量。TCA-NSI(%)=上清液中总氮量/酸与酶解液中总氮量 ×100%

2 结果与分析

2.1 牛骨粉的制备

在 121℃,0.14MPa条件下,高温高压蒸煮牛骨,可使骨骼软化,增加骨中蛋白质的暴露面积,有利于蛋白质的水解。

表 1 不同蒸煮时间对部分牛骨软化及损失率情况

表 1可知,牛骨随蒸煮时间的延长而逐渐软化,蒸煮 90min即可使大部分骨骼软化,蒸煮 120min后骨骼全部软化。随着高温蒸煮时间的延长,损失率也增大,这主要是高温蒸煮使牛骨中明胶及脂肪酸逐渐离游出来。综合考虑牛骨软化程度及损失率,以 121℃,0.14MPa蒸煮 120min处理牛骨为佳。

2.2 柠檬酸与胃蛋白酶水解牛骨粉工艺条件的确定

2.2.1 柠檬酸水解牛骨粉工艺条件的确定

2.2.1.1 不同柠檬酸浓度处理骨粉对水解度和钙溶出率的影响 牛骨粉在酸性条件下加热时,骨蛋白的肽键断裂,使原来在分子内部的非极性基团暴露于分子的表面,有利于水解。表 2可知,当柠檬酸浓度为 0.5mol/L时,水解度和钙溶出率达最大值,分别为 30.0%和 9.6%,比最小值 0.125mol/L时分别高出7.3和 3.2个百分点,提高 32.2%和 50.0%。当柠檬酸浓度大于 0.5mol/L时,随柠檬酸浓度的增大,水解度和钙溶出率有所下降,其机理有待进一步研究。结果表明:柠檬酸浓度以 0.5mol/L为宜。

表 2 柠檬酸浓度对水解度和钙溶出率的影响

2.2.1.2 不同温度处理牛骨粉对水解度和钙溶出率的影响 表 3可知,牛骨粉在酸性条件下经不同的温度处理,其水解度和钙溶出率随温度的升高而增大,121℃时达最大值,分别为 30.1%和 9.7%,比最小值 70℃时分别高出 10.0和 3.9个百分点,提高49.8%和 67.2%。结果表明:以 121℃处理牛骨粉为宜。

表 3 温度对水解度和钙溶出率的影响

2.2.1.3 不同时间处理牛骨粉对水解度和钙溶出率的影响 表 4可知,牛骨粉在酸性条件下经不同的时间水解,30min时,钙溶出率和水解度最高,分别为 30.1%和 9.7%,比最低值 10min时高出 7.6和 3.4个百分点,提高 33.8%和 54.0%。随后略有下降,这是由于加热时间过长造成热变性,使蛋白质分子内部和分子间发生聚合,造成蛋白营养损失。结果表明:水解时间 30min为宜。

表 4 水解时间对水解度和钙溶出率的影响

2.2.1.4 不同处理对牛骨粉水解度和钙溶出率的影响 表 2～表 4可知,实验Ⅰ组与实验Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组比较,牛骨粉经高温处理后,水解度及钙溶出率均明显提高,表明高温处理有助于柠檬酸水解牛骨粉;实验Ⅱ组与实验Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组比较,牛骨粉在酸性条件下高温处理后,水解度及钙溶出率明显提高,表明酸性条件下高温处理有助于柠檬酸水解牛骨粉。

2.2.2 钙溶出率与水解度之间的相关性分析 由表2～表 4可知,钙的溶出率与水解度存在一定的相关性。用 SPSS 12.0软件对不同柠檬酸浓度、温度、时间酶解牛骨粉的水解度 (DH)和钙溶出率进行相关性分析,得出不同预处理条件下水解牛骨粉水解度(DH)和钙溶出率存在极显著(P<0.01)的相关性。

2.2.3 酶解条件的确定

2.2.3.1 不同温度对牛骨粉水解度的影响 温度是酶解条件的重要参数,直接影响蛋白酶催化反应的速度和酶本身的稳定性。图 1可知,温度为 20～37℃时,随温度的升高水解度增大。37℃时水解度达最大值 29.8%;随后随温度的升高水解度反而减小,这是由于温度过高,酶失活,不利于水解。因此,以37℃水解牛骨蛋白为宜。

图 1 不同温度对牛骨粉水解度的影响

2.2.3.2 不同底物浓度对牛骨粉水解度的影响 图 2可知,底物浓度为 3%～9%时,随底物浓度的增加水解度逐渐增大,是由于在酶浓度恒定条件下,当底物浓度较小时,酶未被底物充分接触,这时反应速率取决于底物浓度,随底物浓度增大,酶与底物结合生成中间复合物增多,反应速度加快。底物浓度为 9%时,水解度达最大值 30.1%。当反应的底物浓度超过 9%时,随底物浓度的增加水解度逐渐减小,可能是由于水解液的粘度随底物浓度增加,影响蛋白酶扩散,不利于酶与底物充分接触,不利于水解。结果表明:以底物浓度 9%为宜。

图 2 不同底物浓度对牛骨粉水解度的影响

2.2.3.3 不同酶用量与底物蛋白含量对牛骨粉水解度的影响 图 3可知,当酶与底物蛋白量比在100～300U/g时,E/S与水解度成正比;但当 E/S达300U/g以上时,再增加酶量,溶液中的酶与底物反应达到饱和,水解度趋于平稳。故以 E/S值 300U/g为宜。

2.2.3.4 不同酶解时间对牛骨粉水解度的影响 图 4可知,当酶解 2～5h时,水解度随酶解时间的增加而增大,5h时达 30.1%,而后水解度趋于平稳,这可能是底物被逐渐消耗,产物的抑制作用使酶活力逐渐下降所致。因此,以酶解时间 5h为宜。

图 3 不同 E/S对牛骨粉水解度的影响

图 4 不同酶解时间对牛骨粉水解度的影响

2.2.4 柠檬酸与胃蛋白酶协同水解牛骨粉工艺的优化 根据单因素实验结果,固定柠檬酸水解时间30min,胃蛋白酶酶解温度 37℃,选择柠檬酸浓度、酶解时间、酶与底物蛋白量比 (E/S)、底物浓度四个因素,采用 L9(34)正交实验设计,以蛋白水解度为评定指标,确定最优条件,正交实验设计及结果见表 5。

表 5 L9(34)正交实验结果

采用直观分析法对各因素极差 R值大小比较可知,四因素对水解度的影响程度依次为:B>A>C> D,酶与底物蛋白量比是影响水解度的主要因素,其它依次为柠檬酸浓度,底物浓度,酶解时间对水解度的影响最小。表 5可知,柠檬酸与胃蛋白酶协同水解牛骨粉最佳工艺条件为:A2B3C3D3,即柠檬酸浓度0.5mol/L,酶与底物蛋白量比 500U/g,底物浓度11%,水解时间 6h。验证实验证实此条件下牛骨蛋白的水解度达33.70%,大于实验组最大值,证明其为柠檬酸酸与胃蛋白酶协同水解牛骨蛋白的最佳组合。

2.2.5 水解产物特性分析 三氯乙酸中可溶性氮(TCA-NSI)含量是评价水解产物中小分子肽类的重要指标[11]。三氯乙酸中可溶性氮 (TCA-NSI)含量越大,表明产物为小分子肽类越多。依据优化的实验组对牛骨进行水解,即柠檬酸浓度 0.5mol/L,E/S 500U/g,底物浓度 11%,酶解时间 6h。测得三氯乙酸中可溶性氮(TCA-NSI)含量和可溶性钙的含量达97.2%和 11.2%,表明柠檬酸与胃蛋白酶协同水解牛骨蛋白产物绝大部分为小分子肽类,溶解性较高。

3 结论

3.1 牛骨在 121℃,0.14MPa高温高压下蒸煮 120min后骨骼全部松软,骨中蛋白质的暴露面积增加,有利于蛋白质的分解。

3.2 柠檬酸水解牛骨粉,水解度与钙溶出率呈极显著(P<0.01)的相关性。

3.3 柠檬酸与胃蛋白酶协同水解牛骨粉的最佳条件:柠檬酸浓度 0.5mol/L、酶与底物蛋白量比 (E/S)为 500U/g、底物浓度 11%、反应时间为 6h,水解度和钙溶出率分别达 33.7%和 11.2%。

3.4 柠檬酸与胃蛋白酶水解产物的 TCA-NSI达到97.2%,表明大部分产物为低分子肽类,具有高溶解性。

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Opti m ization of cooperative hydrolysis process of cattle bone powder by citric acid and pepsin

Y IN Yan-yang1,LUO A i-ping1,＊,W U Xian-wei1,W UM in2
(1.Guizhou University College ofLife Sciences,Guiyang 550025,China; 2.Tongren Vocational and Technical College,Tongren 554300,China)

Fresh bone as raw m a te ria l to exp lore the p rep a ra tion of ca ttle bone p owde r,use of control and orthogona l exp e ri m enta l des ign,use of c itric ac id and p ep s in in the coord ina tion of hyd rolyzed p rote in, cha rac te rized by the deg ree of hyd rolys isind ica tors,Trichloroace tic ac id of solub le nitrogen ac id hyd rolys is nitrogen content to be in effec t.The results showed tha t:bone a t121℃,0.14M Pa cond itions,a ll soft120m in cooking, exp osure to inc rease the s ize of p rote in,benefic ia l to the decomp os ition;c itric ac id hyd rolys is ca ttle bone p owde r, the deg ree of hyd rolys is and ca lc ium d issolution ra te was highly s ignificant(P<0.01)re la tionship.C itric ac id and p ep s in hyd rolys is ca ttle bone m ea l in the bes t cond itions we re:c itric ac id concentra tion of0.5m ol/L,enzym e and p rote in subs tra te ra tio(E/S)400U/g,subs tra te concentra tion of11%,reac tion ti m e4h,hyd rolys is and d issolution ra te of ca lc ium up to33.7%and11.2%.Trichloroace tic ac id solub le nitrogen content reached97.2%.M os t of the p roduc twas the low-m olecula r-we ight p ep tides w ith high solub ility.

ca ttle bone p owde r;c itric ac id;p ep s in;hyd rolys is;ca lc ium d issolution ra te

TS251.94

B

1002-0306(2010)03-0248-04

2009-04-08 ＊通讯联系人

尹彦洋 (1983-),男,硕士研究生,主要从事畜产品加工研究与开发。

贵州省科技厅资助项目(黔科合NY字[2007]3021号)。