过氧化物酶体增殖物激活受体γ在大鼠气道黏液高分泌中的表达及意义＊

张湘燕，刘维佳，姚红梅，冯端兴，张 程

（贵州省人民医院呼吸内科，贵阳550002）

呼吸道过度分泌黏液和黏液成分改变所致的黏稠度增加可引起气流阻塞和呼吸道反复感染。近年来研究证明，气道黏液高分泌增加了慢性气道疾病的住院率及病死率，是影响病情和预后的独立危险因素［1］。由于目前尚无治疗气道黏液高分泌特异有效的药物，因此进一步阐明气道黏液高分泌的发生机制，将有助于干预气道黏液调控的重要环节，有效控制气道黏液高分泌。本研究以大鼠为研究对象，探讨过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptorγ，PPARγ）在内毒素诱导气道黏液高分泌中的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 内毒素E.coli 055∶B5（美国Sigma公司）、黏蛋白5AC（MUC5AC）单克隆抗体（美国Neomarkers公司）、PPAR－γ多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司）、免疫组化染色SP试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）、RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（立陶宛MBI公司）、Taq DNA聚合酶及dNTP（美国Promega公司）等。

1.2 动物模型制备及分组 健康清洁级雄性SD大鼠12只，体质量200～220g，鼠龄10～12周，随机分为对照组和内毒素组。对照组以1%戊巴比妥钠（50mg／kg）腹腔注射，麻醉生效后切开颈部皮肤，暴露气管，向气管内注入生理盐水100μL，随后将大鼠直立，并轻轻晃动1～2min。内毒素组操作方法同前，参考Yanagihara等［2］的方法，气管内注入浓度为2g／L的LPS 100μL。

1.3 标本收集 气管注药后第4天，腹腔注射1%戊巴比妥钠50mg／kg麻醉大鼠，取其右中肺置于4%甲醛中固定，剪取靠近中心气道的其余右肺组织置液氮中保存备用。

1.4 气道上皮杯状细胞计数及黏液物质测定 采用HE及阿辛蓝－过碘酸雪夫（AB－PAS）染色进行杯状细胞计数及检测气道黏液物质表达。于光镜（×200）下采集5个完整的支气管横断面图像，计算杯状细胞占所有上皮细胞的比例，并采用积分法进行半定量分析，杯状细胞占上皮细胞比例：＜5%为0分；≥5～25%为1分；＞25～50%为2分；＞50～75%为3分，＞75%为4分。应用IMAGE－Pro plus4.5图像分析系统以相对着色面积表示气道黏液物质的表达。

1.5 气道及肺组织MUC5AC、PPAR－γ蛋白测定 用免疫组化链菌素过氧化物酶连接（SP）法检测气道及肺组织MUC5AC、PPARγ表达。用PBS代替一抗作阴性对照。阳性细胞呈棕黄色。高倍镜下观察MUC5AC为胞浆显色，PPARγ为胞核显色。应用IMAGE－Pro plus4.5进行图像分析，以平均积分光密度为指标对免疫组化染色进行定量分析。

1.6 检测气道及肺组织 MUC5AC、PPARγmRNA表达 采用实时定量PCR（real－time PCR）检测 MUC5AC、PPARγmRNA表达。取靠近中心气道及右肺组织，用Trizol常规一步法提取气道及肺组织总RNA。按cDNA合成试剂盒说明配置反应体系，在PCR仪中进行反应，逆转录合成第1条cDNA，以此为模板分别加入 MUC5AC、PPARγ、甘油醛－3－磷酸脱氢酶（GAPDH）引物及荧光染料在实时定量PCR仪上进行扩增，94℃预变性2min，94℃变性20s，50℃复性30s，72℃延伸40s，共40次，72℃再延伸5min。MUC5AC引物序列：上游引物5′－TCC TTC TTG TCA ATG GTG TCT－3′，下游引物5′－ACC AGG TTC AGG ACA AGT AG－3′，扩增长度为151 bp。PPAR－γ引物序列：上游引物5′－GTC TCA CAA TGC CAT CAG GTT－3′，下游引物5′－TTC AGC TGG TCG ATA TCA CT－3′，扩增长度为90bp。GAPDH引物序列：上游引物5′－CCT CAA GAT TGT CAG CAA T－3′，下游引物5′－CCA TCC ACA GTC TTC TGA GT－3′，扩增长度为141bp。上述引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。将实时定量PCR仪检测荧光强度的时相统一设定在扩增反应退火期，采用50℃、30s作为退火期。测定各样品循环阈值（Ct值），并与标准曲线进行比较，计算目的基因相对于管家基因的定量。

1.7 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件进行统计学分析。数据以±s表示，多组间均数比较采用方差分析，均数两两比较采用q检验。相关性分析采用Pearson法。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 气道上皮杯状细胞及黏液物质的变化 与对照组比较，内毒素组气道上皮杯状细胞积分及气道黏液物质的表达明显增加（表1）。

表1 两组大鼠气道上皮杯状细胞积分及黏液物质变化（±s，n＝6）

表1 两组大鼠气道上皮杯状细胞积分及黏液物质变化（±s，n＝6）

＊：与对照组比较，P＜0.01。

组别 杯状细胞积分（分） AB－PAS染色阳性相对着色面积（%）对照组0.50±0.11 4.18±0.70内毒素组 2.73±0.33＊ 56.49±9.57＊

2.2 气道及肺组织MUC5AC、PPARγ蛋白及mRNA的表达MUC5AC阳性染色颗粒主要见于支气管黏膜上皮，部分见于黏膜下腺体（插页Ⅰ图1、2）。与对照组比较，内毒素组气道及肺组织MUC5AC蛋白及mRNA表达明显增加。PPARγ阳性染色颗粒主要见于气道上皮细胞、气道及肺泡周围浸润的炎症细胞。与对照组比较，内毒素组气道及肺组织PPAR－γ蛋白及mRNA表达增加（表2）。

2.3 相关性分析 内毒素组气道及肺组织PPARγ蛋白表达水平与气道及肺组织MUC5AC mRNA表达水平呈负相关（r＝－0.829，P＜0.05）。

表2 两组大鼠气道及肺组织MUC5AC、PPARγ蛋白及mRNA的表达（±s，n＝6）

表2 两组大鼠气道及肺组织MUC5AC、PPARγ蛋白及mRNA的表达（±s，n＝6）

＊：与对照组比较，P＜0.05。

组别MUC5AC平均积分光密度 相对拷贝数PPARγ平均积分光密度 相对拷贝数对照组 1785.00±236.05 2.42±0.68 825.84±107.02 2.23±0.53内毒素组 3998.95±513.13＊ 39.03±9.43＊ 1121.08±202.53＊ 6.00±1.44＊

3 讨 论

气道黏液主要由气道上皮杯状细胞、黏膜下腺体分泌，适量黏液分泌对保持黏膜湿润、防御病原微生物和有害物质的侵入及维持黏液纤毛清除功能具有重要作用。黏蛋白（mucin，MUC）质和量的变化对黏液的黏弹性起主要作用，其中由杯状细胞产生的MUC5AC不管是在健康个体还是气道疾病患者都是气道分泌黏液中最主要的黏蛋白成分［3］。MUC过度表达、气道上皮杯状细胞、黏液分泌细胞增生与化生以及贮存的黏蛋白分泌增多是气道黏液高分泌发生的主要病理机制。许多因素，如空气污染物、细菌成分、细胞因子、炎症介质等都可增加气道上皮细胞MUC表达，导致气道黏液高分泌。由于细菌感染是慢性气道疾病发生、发展和反复加重的重要因素，尤其革兰阴性菌是最主要的致病菌之一，因此感染对MUC表达信号通路的调控倍受关注。

PPARγ于1990年由Issemann和Green［4］首先从小鼠肝脏克隆出来，是一类由致密分子构成依赖配体激活的核转录因子，主要功能是与配体结合后通过对靶基因转录的调节引起蛋白合成和使生物学效应发生改变。早期研究认为，PPARγ的功能仅限于调控脂肪细胞分化、脂质和糖代谢。近年来研究发现，PPARγ除具有调节脂肪代谢、糖代谢、细胞分化凋亡等生物学效应外，还可能参与炎症控制并具有免疫调节作用［5］。对呼吸系统的研究发现，气道上皮、支气管黏膜下层和气道平滑肌均有 PPARγ表达，可能与慢性气道炎症有关［6－7］。Birrel等［8］对大鼠预先给予PPARγ激动剂——罗格列酮处理，能明显减少内毒素（LPS）刺激引起的气道中性粒细胞聚集和多种细胞因子的释放。在哮喘的动物模型中，雾化吸入罗格列酮后可使IL－2、IL－4和IFN－γ等细胞因子产生减少，肺部炎症减轻，黏液分泌减少［9］。本研究结果显示，在正常大鼠气道及肺组织有少量PPARγ蛋白及mRNA表达，气管内注射LPS后气道上皮杯状细胞、气道黏液物质、气道及肺组织MUC5AC蛋白及mRNA表达明显增加，机体出现气道黏液高分泌改变，同时气道PPARγ蛋白及mRNA表达亦有所增加。表明LPS作为革兰阴性细菌细胞壁外膜的主要结构成分，侵入机体后可刺激气道上皮杯状细胞数目增多，上调气道上皮细胞MUC基因MUC5AC的表达，促进MUC的合成，而PPARγ参与了细菌诱导气道黏液高分泌的发生。进一步的相关性分析显示，气道及肺组织PPARγ蛋白表达水平与气道及肺组织MUC5AC mRNA表达呈负相关，提示PPARγ对LPS诱导的气道黏液高分泌可能存在负性调控作用，但具体的调控机制是否与PPARγ的抗炎作用有关尚待深入研究。

［1］ Groneberg DA，Wagner U，Chung KF.Mucus and fatal asthma［J］.Am J Med，2004，116（1）：66.

［2］ Yanagihara K，Seki M，Cheng PW.Lipopolysaccharide induces mucus cell metaplasia in mouse lung［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2001，24（1）：66.

［3］ Young HW，Williams OW，Chandra D，et al.Central role of MUC5AC expression in mucous metaplasia and its regulation by conserved 5′elements［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2007，37（3）：273.

［4］Issemann I，Green S.Activation of a number of the steroid hormone receptor surperfamily by peroxisome proliferators［J］.Nature，1990，347：645.

［5］ Lee KS，Park SJ，Kim SR，et al.Modulation of airway remodeling and airway inflammation by peroxisome proliferator－activated receptor gamma in a murine model of toluene diisocyanate－induced asthma［J］.J Immunol，2006，177（8）：5248.

［6］ Wang AC，Dai X，Luu B，et al.Peroxisome proliferators－activated receptor－gamma regulates airway epithelial cell activation［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2001，24：688.

［7］ Ward JE，Tan X.Peroxisome proliferator activated receptor ligands as regulators of airway inflammation and remodelling in chronic lung disease［J］.PPAR Res，2007，2007：14983.

［8］ Birrel MA，Patel HJ，Mccluskie K，et al.PPAR－gamma agonists as therapy for diseases involving airway neutrophilia［J］.Eur Respir J，2004，24：18.

［9］ Honda K，Marquillies P，Capron M，et al.Peroxisome proliferator－activated receptor gamma is expressed in airways and inhibits features of airway remodeling in a mouse asthma model［J］.J Allergy Clin Immunol，2004，113：882.