SUMO－1mRNA诊断肝癌的价值研究＊

郭武华，袁丽华，肖志华，罗良平，余 婷，张吉翔△

（南昌大学第二附属医院／江西省分子生物重点实验室：1.肿瘤科；2.消化科 330006）

SUMO－1基因是 SUMO（small ubiquitin－like modifier）基因家族中的一员，主要参与蛋白质翻译后功能的修饰，在转录、DNA修复、核质物质转运及染色体分离等方面发挥重要作用［1－2］。现已发现，SUMO－1的修饰调节了许多与癌症发生、发展及转移有关的蛋白的功能，如p53、增殖细胞核抗原、雌激素受体、端粒酶等［3－7］，提示 SUMO－1基因与癌症发生、发展密切相关。作者前期研究发现，SUMO－1基因在肝癌细胞株SMMC－7721、HepG2、Hep3B以及临床肝癌标本中均明显高表达，而癌旁肝组织中SUMO－1基因表达较低［8］。本实验通过检测临床肝癌、肝血管瘤及肝局灶性结节性增生标本中SUMO－1mRNA表达水平，以进一步评价SUMO－1基因诊断肝癌的应用价值。

1 材料与方法

1.1 标本来源 肝癌、癌旁肝组织、肝血管瘤及肝局灶性结节性增生标本均来自本院外科2007年11月至2008年12月行肝切除患者，均经术后病理检查确诊。共检测20例，其中男16例，女4例。肝细胞性肝癌术前甲胎蛋白（AFP）＜8.0 ng／mL（本院正常值上限）4例，肝细胞性肝癌术前AFP＞400 ng／mL 4例；肝内胆管细胞癌4例，肝血管瘤7例，肝局灶性结节性增生1例。

1.2 仪器设备 PCR热循环仪（GeneAmp®PCR System 9600）及Gene Genius Match（syngene）全自动凝胶成像分析系统。

1.3 主要试剂 RNA 提取试剂 Trizol（Invitrogen）、RT－PCR试剂、Oligo（dT，Promega）、M－mLV RT 5×buffer（Promega）、dNTP（Generay Biotech）、Rnase抑制剂（Promega）、M－mLV 逆转录酶（Promega）、Master Mix（2×Taq PCR，Tiangen）、DNA ladder（Tiangen）等。

1.4 PCR引物 从http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov的 Gen－Bank中获得人SUMO－1、β－actin基因序列，应用 Primer Primier5.0软件设计引物，由Generay Biotech公司合成（表1）。

1.5 RT－PCR检测SUMO－1mRNA表达 采用 Trizol提取肝癌及癌旁肝组织总RNA，合成cDNA。用PCR扩增每个标本中SUMO－1基因的表达，以β－actin作为内参照。SUMO－1 PCR通过94℃预变性5min，然后94℃、35s，51℃、35s，72℃、35s30个循环，72℃延迟延伸7min。β－actin PCR通过94℃预变性5min，然后94℃、35s，54℃、35s，72℃、35s 30个循环，72℃延迟延伸7min。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳（含0.5μg／mL溴化乙锭），在紫外线灯下观察结果，通过Gene Genius Match全自动凝胶成像分析系统测条带灰度值。各标本SUMO－1mRNA表达量为SUMO－1密度值与各自β－actin灰度值的比值。

表1 PCR反应引物

2 结 果

2.1 SUMO－1mRNA在肝癌中明显高表达，而在癌旁肝组织中表达较低（图1～3）。12例肝癌标本中SUMO－1表达量为0.513±0.065，而癌旁肝组织中 SUMO－1表达量为0.05±0.03，两组SUMO－1mRNA表达水平差异有统计学意义（P＝0.009）。

图1 AFP＞400ng／mL肝细胞性肝癌及癌旁肝组织中SUMO－1mRNA表达水平

图2 AFP＜8ng／mL肝细胞性肝癌及癌旁肝组织中SUMO－1mRNA表达水平

图3 肝胆管细胞性肝癌及癌旁肝组织中SUMO－1 mRNA表达水平

2.2 AFP＞400ng／mL肝细胞性肝癌标本中SUMO－1mR－NA表达水平与AFP＜8.0ng／mL肝细胞性肝癌标本中SUMO－1mRNA表达水平相近（图1、2），SUMO－1表达量分别为0.51±0.08、0.45±0.05，差异无统计学意义（P＝0.426）。

2.3 在肝血管瘤及肝局灶性结节性增生标本中SUMO－1 mRNA 表达水平很低（图4），SUMO－1表达量为 0.079±0.031，与肝癌标本比较，差异有统计学意义（P＝0.046）。

图4 肝血管瘤、肝局灶性结节性增生及病灶旁肝组织中SUMO－1mRNA表达水平

3 讨 论

SUMO是泛素样蛋白家族中的一员，与泛素不同，SUMO与底物蛋白结合后不引起蛋白降解，而是调节蛋白功能［9］。越来越多的蛋白被发现存在SUMO的修饰，这些蛋白的功能离不开SUMO的调节作用。SUMO家族蛋白在进化中高度保守，在脊椎动物中SUMO家族蛋白包括SUMO－1～4，SUMO－1广泛参与人类癌症相关蛋白功能的调节，促进癌症的发生、发展［3－7］。因此SUMO－1与癌症发生、发展关系密切，是癌症发生、发展的一个重要的调节因子。

肝癌是常见恶性肝肿瘤之一，由于起病隐匿、进展迅速，治疗效果较差。现今诊断肝癌的手段除临床表现及体征外，影像学技术特别是CT、MRI的进步在肝癌诊断中发挥不可或缺的重要作用。AFP是部分肝细胞性肝癌分泌的蛋白质，是诊断肝细胞性肝癌的一个重要的参考指标。我国颁布的肝细胞性肝癌的临床诊断标准中，AFP具有重要的确诊价值。AFP＞400ng／mL加上有肝癌特征的影像学检查，即可确诊为肝癌。AFP是我国诊断肝癌的重要参考指标，但不同的肝癌患者其血清AFP水平明显不同，有些肝细胞性肝癌患者外周血AFP在正常值范围，因此寻找一种广泛存在于肝癌中能够协助诊断肝癌的标志物具有重要意义。

有研究发现，在mRNA及蛋白水平SUMO－1基因在肝癌标本中均明显高表达，而癌旁肝组织中SUMO－1基因表达较低［8］。通过RNAi方法，抑制肝癌细胞株SMMC－7721中SUMO－1的表达，可明显抑制 SMMC－7721的生长［10］，提示 SUMO－1与肝癌发展关系密切。本研究采用RT－PCR方法，检测肝癌、癌旁肝组织及肝良性肿瘤中SUMO－1mRNA表达水平，并与临床常用的肝细胞性肝癌标志物AFP对比研究SUMO－1 mRNA诊断肝癌的应用价值。结果显示，在肝癌标本中SUMO－1mRNA表达水平明显高于癌旁肝组织，也明显高于肝血管瘤及肝局灶性结节性增生标本。尽管在不同肝细胞性肝癌患者血清中存在AFP量的差异，但在不同肝细胞性肝癌标本中SUMO－1mRNA均明显高表达，不同AFP水平患者肝细胞性肝癌标本中SUMO－1mRNA表达水平无明显差异，因此鉴于在所有肝癌标本中均有SUMO－1mRNA高表达，SUMO－1 mRNA可成为诊断肝癌的一个有价值的指标。

［1］ Di Bacco A，Ouyang J，Lee HY，et al.The SUMO－specific protease SENP5is required for cell di－vision［J］.Mol Cell Biol，2006，26（12）：4489.

［2］ Martin S，Nishimune A，Mellor JR，et al.SUMO ylation regulates kainate－receptor－mediated synaptic transmission［J］.Nature，2007，447（7142）：321.

［3］ Buschmann T，Fuchs SY，Lee CG，et al.SUMO－1modification of Mdm2prevents its self－ubiquitination and increases Mdm2ability to ubiquitinate p53［J］.Cell，2000，101（7）：753.

［4］ Carter S，Bischof O，Dejean A，et al.C－terminal modifications regulate MDM2dissociation and nuclear export of p53［J］.Nat Cell Biol，2007，9（4）：428.

［5］ Pfander B，Moldovan GL，Sacher M，et al.SUMO－modified PCNA recruits Srs2to prevent recombination during S phase［J］.Nature，2005，436（7049）：428.

［6］ Karamouzis MV，Konstantinopoulos PA，Badra FA，et al.SUMO and estrogen receptors in breast cancer［J］.Breast Cancer Res Treat，2008，107（2）：195.

［7］ Xhemalce B，Riising EM，Baumann P，et al.Role of SUMO in the dynamics of telomere maintenance in fission yeast［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（3）：893.

［8］ 郭武华，袁丽华，肖志华，等.SUMO－1基因在肝癌中的表达及意义［J］.重庆医学，2009，38（24）：2308.

［9］ Ulrich HD.Mutual interactions between the SUMO and ubiquitin systems：aplea of no contest［J］.Trends Cell Biol，2005，15（10）：525.

［10］郭武华，袁丽华，肖志华，等.SUMO－1基因siRNA抑制肝癌细胞SMMC－7721生长的研究［J］.天津医药，2010，38（1）：4.