反相高效液相色谱法测定女贞子中桦木醇含量

张 秋 丰， 弓 晓 杰

( 1.大连大学 环境与化学工程学院， 辽宁 大连 116622;2.大连大学 医学院， 辽宁 大连 116622 )

0 引 言

女贞子为木犀科植物女贞(LigustrumLucidumAit)的干燥成熟果实，为常用中药，是多种成药和成方的主要组分。女贞子中含女贞子苷、齐墩果酸、熊果酸、桦木醇、甘露醇等，其中齐墩果酸、熊果酸和桦木醇均为三萜化合物，有一定的药理活性。桦木醇对女贞子药效有着重要的影响，因此受到广泛关注。桦木醇是一种重要的天然生物活性物质，具有消炎、抗病毒功能，可抑制头发纤维中蛋白质的溶解、改善受损头发光泽、促进头发生长等生理活性，可应用于食品、化妆品及医药行业[2]。三萜化合物的分析方法较多，齐墩果酸和熊果酸的多种分析方法已被大家所知，但对女贞子中桦木醇的含量测定却未见报道。本文用RP-HPLC法对女贞子中桦木醇进行定性定量分析，以期为女贞子成分及药理活性研究提供参考，为药材的质量控制提供依据。

1 仪器与材料

福立FL-2200高效液相色谱系统：FL-2200泵，FL-2200紫外检测器，N2000色谱工作站；电子天平，梅特勒托利多；分析天平，北京金紫光仪器仪表公司。

桦木醇对照品由大连医诺生物有限公司提供，经HPLC测定纯度为96.3%；所用试剂均为色谱纯；实验用水为纯净水。

女贞子药材购自大连东特大药房，经大连大学医学院药学教研室鉴定为木犀科植物女贞的干燥成熟果实。

2 实验方法与结果

2.1 对照品溶液的制备

精确称取桦木醇对照品50 mg，溶于50 mL甲醇，配制成质量浓度为1 mg/mL的对照品溶液，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得对照品储备液，备用。

2.2 样品溶液的制备

精确称取女贞子干燥粉末10 g，过65目筛，用正丁醇200 mL浸泡24 h，然后置超声震荡清洗器中，超声20 min，过滤，分离出溶液。残渣用200 mL正丁醇同法处理，合并两次溶液，减压蒸干溶剂，再用25 mL甲醇溶解固体，经0.45 μm微孔滤膜过滤后移至25 mL容量瓶中，用甲醇定容摇匀。

2.3 色谱条件

色谱柱，Supelcosil LC-PAH C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相，乙腈-水-磷酸[V(乙腈)∶V(水)∶V(磷酸)=830∶170∶1]；检测波长，210 nm；体积流量，1.0 mL/min；进样量为20 μL。桦木醇16.5 min出峰，对照品及供试品色谱图见图1、2。

图1 桦木醇对照品的HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of betulin reference substance

图2 女贞子药材的 HPLC图谱Fig.2 HPLC chromatograms of sample of Fructus ligutric lucidi

2.4 线性关系考察

精确吸取“2.1”项下对照品储备液1、2、4、6、8 mL，分别置于10 mL容量瓶中，甲醇定容，摇匀，得5个不同体积分数的混合对照品溶液。分别精确吸取20 μL，按上述色谱条件进样分析。以质量浓度X(μg/mL)为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线并计算回归方程。回归方程为：Y=257 241X+39 628，R2=0.998 4。结果表明，桦木醇在0.1～0.8 mg/mL内与峰面积有良好的线性关系。

2.5 精密度试验

精确吸取上述质量浓度为0.6 mg/mL的标准对照品溶液20 μL，按上述色谱条件，重复进样5次，测得桦木醇峰面积的RSD为1.25%。

2.6 稳定性试验

取质量浓度为0.4 mg/mL对照品溶液，分别于0、2、6、12、24 h，精密吸取20 μL进样，测得桦木醇峰面积的RSD为1.08%。结果表明，供试品溶液在24 h内稳定性较好。

2.7 重现性试验

取同一批样品5份，精密称定，按供试品溶液制备方法分别制备5份，测定并计算桦木醇的质量分数的RSD为1.94%。

2.8 回收率试验

精确称取已知桦木醇含量样品5份，各取1 g分别精确加入桦木醇对照品适量，按供试品溶液的制备方法进行处理。按上述色谱条件测得桦木醇的平均回收率为98.87%，RSD为1.91%。

2.9 样品测定

精确吸取经微孔滤膜(0.45 μm)滤过后的样品溶液20 μL，在上述色谱条件下进样分析，以外标法计算样品中桦木醇的含量，结果见表1。

表1 样品中桦木醇的测定结果(n= 3)Tab.1 Determination of betulin in samples (n =3)

3 讨 论

3.1 提取条件的选择

根据测定目标桦木醇的理化性质和文献报道[2-3]，提取溶媒应选择对桦木醇溶解性较好的氯仿、乙醇等物质，最后使用对桦木醇溶解性最好的正丁醇作为提取溶剂[4]。正丁醇不仅能够提高供试品浓度，而且能够减少水溶性等杂质的干扰，确定最佳提取条件为以20倍量正丁醇浸泡超声提取2次。此方法简便易行，测定时干扰少。

3.2 色谱条件的选择

桦木醇为五环三萜类化合物，根据参考文献[5-6]对女贞子中齐墩果酸和桦树皮中桦木醇的测定方法，实验中曾采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-水-磷酸、乙腈-水-冰醋酸、乙腈-甲醇-水-冰醋酸等多种流动相。其中加酸的主要作用是调整峰型，通过实验比较冰醋酸和磷酸，发现磷酸较好，峰型较理想。当流动相中有甲醇时发现女贞子中主要成分五环三萜酸类物质(齐墩果酸等)出峰时间延后很多，与桦木醇出峰时间较接近，使桦木醇很难分离。而且桦木醇最大紫外吸收波长为210 nm，紫外末端吸收，甲醇与乙腈相比，乙腈对测定干扰较少，故流动相选用乙腈。流动相的比例开始用桦木醇与桦木酸能够较好分离的乙腈-水-磷酸[V(乙腈)∶V(水)∶V(磷酸)=860∶140∶1]，结果发现女贞子中桦木醇与周围物质没有完全分开，所以为了使桦木醇与周围峰分开，延长出峰时间，增加水的含量，最后确定水的体积分数为17%。实验中发现当水的体积分数大于24%时，虽然物质间被进一步分离，但桦木醇峰型较差，最后确定流动相为乙腈-水-磷酸[V(乙腈)∶V(水)∶V(磷酸)=830∶170∶1]。在此条件下，所得图谱基线平稳，桦木醇与周围物质达到了较好的分离。

女贞子是一种具有广泛用途的常用中药，因此对于它的化学成分和药理活性研究较为重要。本实验采用RP-HPLC法，流动相，乙腈-水-磷酸[V(乙腈)∶V(水)∶V(磷酸)=830∶170∶1]；检测波长，210 nm。外标法对女贞子中的生物活性成分桦木醇进行定性、定量分析，不仅方法简便、易行，而且稳定、重现性好，可以为女贞子的质量控制提供参考，也可以为科学工作者的实验研究提供依据。

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典：一部[M]. 北京:化学工业出版社, 2000:34.

[2] 王石发,张明光,李艳平. 桦木醇提取及纯化工艺的研究[J]. 林产化学与工业, 2007, 27(6):22-26.

[3] 张泽,孙宏. 高效液相色谱法测定白桦树皮中白桦酯醇的含量[J]. 林产化学与工业, 2004, 24(1):61-63.

[4] GAO Dan, ZHAO Guoling, YAN Weidong. Solubilities of betulin in fourteen organic solvents at different temperatures[J]. American Chemical Society, 2007, 52(4):1366-1368.

[5] 石心红,郭江宁,翟静华. HPLC法测定女贞子中齐墩果酸、熊果酸的含量[J]. 海峡药学, 2005, 17(4):41-43.

[6] ZHAO Guoling, YAN Weidong, GAO Dan. Simultaneous determination of betulin and betulinic acid in white birch bark using RP-HPLC[J]. Science Direct, 2007, 43:959-962.