毛苕子绿汁发酵液发酵条件的优化研究

吴进东

随着农村产业结构的调整，畜牧业在农村蓬勃发展起来，作为冬春季青绿饲料的青贮饲料调制越来越受重视。但由于农民缺少青贮调制技术,加之农村的很多青贮原料为豆科饲草和农作物秸秆,水溶性碳水化合物含量少、缓冲能较高,乳酸菌数量少,采用常规青贮技术很难调制优质青贮饲料[1-2]。绿汁发酵液(Previously Fermented Juice，PFJ)是近年研制出的一种青贮添加剂。它的最大特点是经济环保，制作工艺流程简单、生产成本低,青贮效果显著,易于推广[3-5]。研究表明:不同的条件下制作的PFJ效果可能不同,使其应用受到限制。但如何提高改善PFJ的发酵品质,以提高其添加应用效果的研究报道很少。为了更有效地利用PFJ,试验通过在毛苕子(Vicia villosa Roth.)青贮原料中添加不同条件下制作的PFJ,研究其对毛苕子青贮发酵品质的影响，优化出PFJ发酵条件(水草比例、葡萄糖添加剂、氯化钠添加剂)的适宜模式,从而充分利用农村丰富的饲料作物,扩大青贮原料来源,提高青贮饲料品质,为畜牧业的发展、农民的增收做出贡献。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用毛苕子为第一茬初花期，收割时含水量较高，收后晾晒2 h，使水分减少到75%左右，再进行青贮。青贮原料清洁新鲜、无泥土夹杂，剔除过于枯老以及霉变的部分。青贮原料各组成的营养成分见表1。

表1 毛苕子青贮原料的营养成分（%）

1.2 试验设计

试验采用L9(34)正交表设计三因素三水平三重复的正交试验，绿汁发酵液发酵条件模式试验因素水平见表2。将毛苕子切碎至1 cm放入榨汁机，加入相应重量蒸馏水，粉碎榨汁后浸泡30 min，用双层纱布过滤至容器中。水草比例指新鲜毛苕子和所加蒸馏水的质量比，按试验设计加入不同比例的葡萄糖、氯化钠，比例为葡萄糖、氯化钠和绿汁发酵液质量之比，摇匀，分别装入玻璃瓶，添加食用白米醋调节pH值至4.2,密封，于30℃避光发酵48 h。2007年4月28日，将毛苕子用镰刀收割，用铡刀切成理论长度为1 cm的短段，均匀加入不同绿汁发酵液进行青贮试验。装入塑料食品袋内，每袋约1 000 g，抽真空，密封，每个青贮处理作3袋，共27袋。贮藏60 d。

表2 绿汁发酵液发酵条件模式的优化研究试验

1.3 测定项目与方法

1.3.1 实验室评定

绿汁发酵液中的乳酸菌数：采用MRS培养基，平板涂布，30℃有氧培养48 h，计数菌落形成单位(Colony Forming-Unit，CFU)，并计算乳酸菌菌落形成单位的对数(lgCFU)[6]。

青贮料指标：取青贮料样品20 g，加入180 ml蒸馏水，搅拌均匀，静置24 h，用PHS-3C酸度计测定青贮料浸出液的pH值[7]；乳酸(LA)含量测定是用钨酸、硫酸铜和氢氧化钙处理后，用比色法测定乳酸含量[8]；用SQ206气相色谱仪测定浸出液的挥发性脂肪酸（VFA）、乙酸(AA)、丁酸(BA)的含量[9]，并用弗氏(Fleig)评分法评分[10]；氨态氮(NH3-N)和粗蛋白质(CP)的含量用凯氏定氮法测定。

1.3.2 青贮料感官鉴定

青贮饲料感官评定标准参照我国1996年农业部下发的《青贮饲料质量评定标准》[11]。

1.4 数据处理

用SPSS12.0和正交设计助手统计软件进行方差分析和多重比较。

2 结果与分析

2.1 实验室鉴定（见表3）

2.1.1 不同处理对绿汁发酵液中的乳酸菌数影响

青贮效果的好坏与作为青贮添加剂的绿汁发酵液本身乳酸菌数量有着密切的关系。试验中乳酸菌数量以乳酸菌菌落形成单位的对数(lgCFU)表示。由表3的lgCFU值进行极差分析，算出各因素的极差得：RA、RB、RC分别为 0.02、0.63、0.36，而空列极差 RD为 0.07。得：A、B、C三因素及用于估计误差的空列D对lgCFU值的影响大小为B＞C＞D＞A。将A因素影响归于误差项进行方差分析得：因素B内不同水平间lgCFU值差异极显著(F=214.29＞F2,4,0.01=18.00，P＜0.01)，多重比较各水平平均数B3、B2差异不显著，二者均显著大于B1；因素C内不同水平间lgCFU值差异极显著（F=69.43＞F2,4,0.01=18.00，P＜0.01），其各水平平均数 C1、C3差异不显著，二者均小于C2；而因素A内不同水平间lgCFU值差异不显著（P＞0.05）；直观看，试验各处理中以A1B2C2、A3B3C2为优；综合评价最优绿汁发酵液发酵模式应为 A1－3B2－3C2。

2.1.2 添加不同处理绿汁发酵液对青贮饲料pH值的影响

青贮饲料pH值的高低反映其发酵品质，优良青贮饲料的pH值应在4.2以下。由表3的pH值可以直观发现,除处理7的pH值在4.2以上,其它处理的pH值都在4.2以下,达到优良标准。进一步对pH值进行极差分析,算出各因素的极差得:RA、RB、RC分别为0.02、0.35、0.22, 而空列极差 RD为 0.03。 得:A、B、C 三因素及用于估计误差的空列D对pH值的影响大小为B＞C＞D＞A。将A因素影响归于误差项进行方差分析得：各因素对pH值的影响与2.11节中对乳酸菌数影响密切相关。因素B内不同水平间pH值差异极显著(F=151.33＞F2,4,0.01=18.00,P＜0.01),多重比较各水平平均数B3、B2差异不显著,二者均显著小于B1;因素C内不同水平间pH值差异极显著 (F=54.00＞F2,4,0.01=18.00,P＜0.01),其各水平平均数C1、C3差异不显著，二者均显著大于C2;而因素A内不同水平间pH值差异不显著(P＞0.05);直观看,试验各处理中也以 A1B2C2、A3B3C2为优;综合评价最优绿汁发酵液发酵模式应为A1-3B2-3C2。

表3 L9(34)正交表和绿汁发酵液及青贮料的正交试验结果

2.1.3 添加不同处理绿汁发酵液对青贮饲料有机酸含量的影响

在各种有机酸中，乳酸、乙酸和丁酸含量是衡量青贮饲料品质的三个重要指标。乳酸是由乳酸菌发酵产生，一般来说乳酸含量越高青贮品质越好。乙酸是一种挥发性有机酸，是大肠杆菌等发酵糖分的主要产物，主要产生在发酵初期。丁酸，也是一种挥发性有机酸,具有难闻的气味,使青贮料发臭,降低营养价值，一般在青贮后期由酪酸菌发酵产生,发生丁酸发酵的饲料，青贮品质较差。有机酸构成可以反映青贮发酵过程的好坏。该指标可以采用世界通用的修订后的弗氏评分法进行评分。由表3的弗氏评分可以直观算出各因素的极差得：RA、RB、RC分别为 1.00、11.00、5.67,而空列极差RD为0.34。通过极差分析得：A、B、C三因素及用于估计误差的空列D对弗氏评分的影响大小为B＞C＞A＞D,因此,不能将A因素影响归于误差项,以空列D估计误差进行方差分析得:因素A内不同水平间弗氏评分差异不显著(F=7.01＜F2,2,0.05=19.00，P＞0.05);而因素B内不同水平间弗氏评分差异极显著 (F=950.00＞F2,2,0.01=39.00,P＜0.01),多重比较各水平平均数B3、B2差异不显著,二者均显著大于B1;因素C内不同水平间弗氏评分差异极显著 (F=259.26＞F2,2,0.01=39.00,P＜0.01),其各水平平均数C1、C3差异不显著，二者均显著小于C2。直观看，试验各处理中也以A1B2C2、A3B3C2为优；综合评价最优绿汁发酵液发酵模式应为A1-3B2-3C2。同时由表4得：各处理的丁酸占总酸比值差异不显著；而乳酸占总酸比值和乙酸占总酸比值差异显著。

2.1.4 添加不同处理绿汁发酵液对青贮饲料氨态氮/总氮（NH3-N/TN）的影响

氨态氮与总氮的质量比，反映了青贮饲料中蛋白质和氨基酸分解的程度，因为正常青贮料中蛋白质只分解至氨基酸，氨存在则表示有腐败现象，该值越大说明蛋白质和氨基酸分解越多，意味着青贮饲料品质不佳[10]。由表3的NH3-N/TN可以直观对其进行极差分析，算出各因素的极差得：RA、RB、RC分别为 0.80、7.00、3.97，而空列极差 RD为 1.17。 得：A、B、C 三因素及用于估计误差的空列D对氨态氮/总氮的影响大小为B＞C＞D＞A。将A因素影响归于误差项进行方差分析得:因素B内不同水平间氨态氮/总氮差异极显著(F=52.35＞F2,4,0.01=18.00,P＜0.01),多重比较各水平平均数B3、B2差异不显著,二者均显著小于B1;因素C内不同水平间氨态氮/总氮差异显著 (F=17.27＞F2,4,0.05=6.49,P＜0.05)，其各水平平均数C1、C3差异不显著,二者均显著大于C2;而因素A内不同水平间pH值差异不显著(P＞0.05);优化所得绿汁发酵液发酵模式为A1-3B1-3C2。

2.2 青贮料的感官鉴定结果

感官评定参照我国1996年农业部下发的 《青贮饲料质量评定标准》，综合青贮饲料嗅觉、结构、色泽三项得分给出评定结果见表4。除了处理A3B1C3为“中等”等级，其它各处理均为“优良”等级。综合分析，各添加剂处理均显著提高了青贮饲料品质，和实验室评定结论基本一致。

表4 正交试验感官鉴定及有机酸质量分数结果

3 结论与讨论

3.1 试验表明：葡萄糖、氯化钠添加量对毛苕子绿汁发酵液的乳酸菌含量、青贮饲料的pH值、弗氏评分、氨态氮的影响显著；葡萄糖最佳添加量为2%或5%；氯化钠最佳添加量为0.5%。水草比例对上述指标影响不显著。理论上可以认为：毛苕子绿汁发酵液的适宜发酵条件模式为2：1或5：1或10：1的水草比例+2%或5%的葡萄糖添加量+0.5%的氯化钠添加量；考虑到生产的实用性，推荐在生产中使用的优化模式为10：1的水草比例+2%的葡萄糖添加量+0.5%的氯化钠添加量。这说明稀释2～10倍绿汁发酵液均可为发酵过程提供有效活菌种，促进发酵，在生产中能够一样发挥其促进乳酸发酵，显著改善青贮发酵品质的作用；添加2%葡萄糖就可以促进绿汁发酵液发酵，抑制了有害微生物对蛋白质的分解作用，提高了毛苕子绿汁发酵液的效果；添加适量氯化钠(0.5%)可以抑制有害微生物，提高发酵品质，但是高的氯化钠（1%）添加量对有害细菌的抑制同时也对乳酸菌菌系抑制，导致乳酸产生减少，pH值终值较高，有害微生物受到的抑制作用有限，导致绿汁发酵液中的乳酸菌含量减少，而氨态氮含量增多。

3.2 试验只选择了3个绿汁发酵液发酵条件，水平只设3个，无法准确建立各指标和绿汁发酵液发酵条件模式之间的更精确的关系。如要得到更精确的最适绿汁发酵液发酵条件则需增加试验因素和水平。另外如有可能，应延长试验时间再结合动物试验来综合评判青贮饲料的适口性、消化率等指标，以使评定结果更为客观准确，为今后农作物青贮技术提供科学依据。

[1]董卫民.秸秆饲料开发利用现状及前景展望[J].草业科学,2002,19(3):53-54.

[2]韩鲁佳,刘向阳,阎巧娟,等.我国秸秆饲料资源开发利用的研究[J].农业工程学报.1997,13(增刊):120-124.

[3]Ohshima M,Kimura E,Yokota H.A method of making good quality silage from direct alfalfa by spraying previously fermented juiced[J].Animal Feed Science and technology,1997,66:129-137.

[4]张涛，崔宗均，胡跃高，等.绿汁发酵液和乳酸菌剂MMD3在不同含水率苜蓿青贮中的添加试验[J].中国农业大学学报，2004,9(5):32-37.

[5]玉柱.牧草青贮技术研究[D].北京:中国农业大学，2002:35-42.

[6]许庆方，韩建国，周禾，等.苜蓿绿汁发酵液特性的研究[J].草地学报，2005，13(14)：295-298.

[7]杨富裕，周禾，韩建国，等.添加甲醛对草木犀青贮品质的影响[J].中国草地,2004(1):43-46.

[8]邱碧丽.临床生化检验[M].上海：上海科学技术出版社,1982:53-55.

[9]郭金双.不同青贮饲料添加剂对青贮饲料品质的影响[D].北京：中国农业大学，1998.

[10]董宽虎,沈益新.饲草生产学[M].北京：中国农业学社出版,2003：255-259.

[11]刘建新，杨针海，叶均安，等.青贮饲料的合理调制与质量评定标准[J].饲料工业，1999，20(3):25-27.