断奶仔猪肠黏膜免疫与功能性氨基酸的营养

高玉云 余 钗 袁智勇 陈启青

仔猪断奶后，由于母乳中被动免疫成分的停止供应以及自身免疫系统尚未发育成熟，不能有效利用日粮中的复杂多糖和植物蛋白(Grinstead等，2000)，且容易受到疾病的感染（Deprez等，1986），断奶会导致仔猪肠道形态的改变,如小肠绒毛萎缩和隐窝增生（Kelly等，1992），此外，刷状缘酶活性也会减少，导致小肠吸收能力的损伤（Hampson 和 Kidder，1986；Hampson，1986）。以上原因都会导致腹泻等疾病的发生，给养猪生产造成了巨大的经济损失。

黏膜组织是一个巨大的外环境表面，是机体和外界环境进行交流的场所，断奶仔猪肠道黏膜免疫在肠道黏膜防御机制中起重要作用。因为大部分病原微生物的入侵都是通过黏附在断奶仔猪肠道黏膜表面，然后通过黏膜细胞的转运而进入体内。在正常生理状况下，肠黏膜免疫系统处于大量抗原包围中，既要维持肠黏膜重要的生理功能，对外来食物抗原产生免疫耐受，保障机体对营养物质的消化和吸收；又要发挥黏膜防御功能，对肠道内条件致病菌、外来菌进行免疫监视和清除；同时还要调节肠道微生物菌群的稳态（Neutra 等，2001；Bouskra 等，2008）。 其中肠相关性淋巴样组织是机体免疫系统的重要组成部分，其主要功能是作为机体的防御屏障，清除和排斥外源分子，保护机体免受损害。

1 肠黏膜系统的结构和功能

肠道内的黏膜免疫系统由肠相关淋巴组织（gutassociated lymphoid tissue，GALT）组成。GALT 主要以两种形式存在：一种为组织化的淋巴组织（organized lymphoidtissue），如派氏结（Payer patch，PP）、肠系膜淋巴结（mesenteric lymphoid node，MLN）及较小的孤立淋巴滤泡。这些淋巴组织是肠道黏膜免疫系统的诱导位点（inductive site）。其中，特别要指出的是PP区域的滤泡相关上皮中存在的一种特殊的M细胞（microfold cell，微皱褶细胞）。M细胞能够主动吞饮抗原，表现出高度的跨细胞转运活性；另一种是呈弥散分布的淋巴组织（scattered lymphoid tissue），即肠黏膜上皮内淋巴细胞 （intraepithelial lymphocyte，IEL） 及固有层（lamina propria，LP）内散在的淋巴细胞，它们是肠道黏膜免疫系统免疫保护功能的效应位点（effector site）。

1.1 肠黏膜免疫的诱导位点

仔猪出生时PP就完全形成，出生后前几天可观察到淋巴细胞的增殖、扩散和迅速形成淋巴组织。在猪的空肠和回肠上段约有30个相互独立、弥散分布的PP，在回肠末段有连续的PP，在结肠也有10个不规则的PP，PP中的T淋巴细胞（CD4+和 CD8+）在出生后不断增加。PP是最典型的黏膜淋巴样滤泡，在结构上可分为三个区：圆顶区、具有生发中心的淋巴小结区（B细胞区）和T细胞依赖区。PP的一个重要特征就是覆盖在圆顶区上的淋巴上皮中有特殊的抗原捕捉细胞——M细胞。M细胞的微皱褶之间具有许多胞饮部位，在M细胞的基底面凹陷成袋状，袋中含有T细胞、B细胞及巨噬细胞。当黏膜表面的抗原与M细胞膜结合后，M细胞便将其吞入形成吞噬小泡，再直接迅速转运至M细胞基底膜侧，并将抗原释放入上皮下淋巴细胞(Neutra 等，2001；Wittig 等,2003；Lotz等,2007)。因此，M细胞被认为在向肠道集合淋巴结传递抗原方面发挥重要作用。当抗原被转运到PP后，在滤泡区受到加工并传递给T细胞和B细胞，引起抗原特异性B和T淋巴细胞兴奋。随后,它们离开PP并通过系统循环(通过肠系膜淋巴结进入血液循环)迁移回黏膜固有层，在LP分化成可以分泌大量抗体的浆细胞（Kelly 等，2007；Lotz等，2007）。

1.2 肠黏膜上皮内淋巴细胞

肠上皮内淋巴细胞（IEL）位于肠绒毛上皮细胞之间，存在于动物的十二指肠、空肠、回肠中，其中以空肠中最多。绝大多数IEL是T细胞，且多数为CD8+T细胞，其他的为CD4+和CD3+T细胞。肠上皮内淋巴细胞的T细胞与脾脏或外周淋巴结中的T细胞有许多不同之处，主要表现在肠上皮内淋巴细胞的T细胞可表达CD69和αEβ7整合素，因此，肠上皮内淋巴细胞的T细胞对丝裂原的刺激很少产生增殖反应（Agrawal等，1999）。IEL 还可分泌 IFN-γ、IL-5、IL-2、TFN-α等细胞因子。此外，虽然有学者认为IEL在监测上皮细胞瘤、抵抗病原菌、促进肠损伤后的修复有重要作用，但是IEL的确切功能还不是很清楚 （Hayday等，2001；Cheroutre，2004）。

1.3 肠黏膜固有层淋巴细胞

肠道黏膜固有层淋巴细胞由混合的淋巴细胞所组成，有T细胞也有B细胞，还包括淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞及肥大细胞。T淋巴细胞主要是CD3+、CD4+和CD8+，其中以CD4+T细胞居多，CD8+T细胞相对较少，CD4+T细胞主要为TH2辅助细胞，并且能够产生TGF-β、IL-4、IL-5、IL-6 和 IL-10 等细胞因子（Wittig等，2003）。 这些T淋巴细胞在肠系膜淋巴结内识别抗原并发生反应，然后迁移并定居在黏膜固有层。固有层中的B细胞以IgA分泌细胞为主，IgG、IgM分泌细胞较少。

因此，固有层是黏膜免疫应答的主要场所，浆细胞所分泌的大量IgA可通过分泌片的介导进入黏膜表面，中和抗原，起到清除外来抗原保护机体的目的。

1.4 分泌型IgA（secretory IgA，sIgA）

黏膜免疫反应主要是以其sIgA的大量产生为特点，sIgA作为黏膜免疫的主要效应因子，主要存在于初乳、唾液以及消化道、呼吸道、泌尿生殖道的分泌液中，它是构成肠道黏膜免疫的主要产物。sIgA一般由两个单体IgA分子形成的二聚物、J链和分泌片（secretory component，SC）构成。sIgA不但在阻止抗原进入上皮组织的过程中有着重要作用（Brandtzaeg，2003），还可以保护正常菌群免受先天免疫和系统免疫反应（Macpherson，2001）。sIgA缺乏会导致肠道正常菌群过量生长，从而进入肠道黏膜上皮并导致异常的免疫系统反应（Iweala，2006）。sIgA的产生受Th细胞分泌的细胞因子的调控（见表1）。

表1 Th分泌的细胞因子对IgA的调控

此外,研究证明,同样的抗原刺激黏膜淋巴细胞组织可产生高含量的sIgA,而且某处黏膜内受抗原刺激的免疫活性细胞可游走到另一处黏膜,并在那里产生抗体。例如经口摄入细菌性抗原后,可在乳汁中发现该特异性抗体。据此，提出了共黏膜免疫系统的概念，即消化道、呼吸道、泌尿生殖道黏膜以及乳腺、唾液腺和宫颈腺等的上皮共同构成了这种黏膜免疫网络。

1.5 细胞因子

细胞因子（Cytokines）是指一类由免疫细胞（淋巴细胞、单核-巨噬细胞等）和相关细胞（成纤维细胞、内皮细胞等）产生的调节细胞功能的高活性多功能多肽或蛋白质分子，它不包括免疫球蛋白、补体和一般生理性细胞产物。主要有：白细胞介素（IL）、淋巴因子（LK）、干扰素（IFN）、表皮生长因子（EGF）、胰岛素样生长因子-1（IGF-1）、神经生长因子（NGF）等。

早期断奶引起机体代谢、免疫及血液动力学的改变，细胞因子作为免疫与急性期炎症反应的介质起重要作用（Tilg等，1997）。细胞因子之间通过合成分泌进行相互调节、相互影响而形成细胞因子的网络效应。目前认识到在细胞因子网络中，促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子的平衡是机体产生正确免疫应答的关键。在炎症和免疫介导的损伤过程中，组织修复机制的激活过程主要受细胞因子调节（Krishnaswamy等，1999）。此外，上皮细胞与淋巴细胞通过细胞因子的联络和“交谈”，对黏膜免疫功能起着重要作用。肠炎时细胞因子也发挥重要作用。

2 肠黏膜免疫应答过程

当外界抗原黏附于肠道上皮时，M细胞可以吸收完整的大分子、颗粒和病原菌，通过胞饮作用将它们传递给上皮下的树突状细胞（dendritic cell，DC），滤泡相关上皮（follicle-associated epithelium，FAE）分泌的细胞因子可以使DC聚集到上皮下面的区域。DC和其他抗原提呈细胞（antigen presenting cell，APC）加工和提呈抗原给Th细胞，从而诱导特异的B细胞和T细胞活化，然后这些已经活化的细胞离开PP经胸导管进入体循环，B细胞增殖为可以分泌IgA的浆细胞，通过淋巴或血液再次迁徙到肠黏膜组织中（称为归巢现象）和远的黏膜组织中，从而产生广泛的局部分泌sIgA抗体反应。

淋巴细胞归巢是指抗原通过黏膜中M细胞激活固有层中B淋巴细胞，致敏的IgA B细胞前体通过淋巴或血液再迁移到肠黏膜组织、远的黏膜组织和腺体的现象。淋巴细胞的归巢是由淋巴细胞表达的黏附因子与黏膜血管内皮表达的组织特异性配体相互作用启动。淋巴细胞的黏附因子主要是整和素（integrin）和L-选择素（L-selection）。目前认为 Integrinα4β7 分子是淋巴细胞向PP定向归巢的特异受体，黏膜血管地址素（mucosal vascular addression，Mad）是 PP 静脉内皮细胞表达的与Integrinα4β7结合的配体，两者相互作用构成了特定淋巴细胞向PP定向归巢的基础。

3 功能性氨基酸的营养与免疫作用

蛋白质缺乏会损害动物免疫功能并导致其对疾病的易感性增加，但其潜在的细胞和分子方面的机理却还未完全阐明。氨基酸是合成许多具有生物学活性物质（包括一氧化氮、多胺、谷胱甘肽、核苷酸、激素和神经递质）的底物，而这些生物学活性物质对动物的生命和繁殖都是必不可少的，这或许可以为其对免疫作用的调控提供依据。

传统上理论上,我们会直接关注必需氨基酸在动物营养中的作用。但是近年来,非必需氨基酸和条件性必需氨基酸在代谢调节和生理学方面独特的、多样的功能也被逐渐发现,它们的功能正在引起营养学家的重视。谷氨酰胺、精氨酸和半胱氨酸在增强免疫功能方面的作用已经被证实(Field等,20002;Wu等,2004c)。

3.1 谷氨酰胺与免疫

谷氨酰胺是机体内最丰富的条件性必需氨基酸，约占总游离氨基酸的60%，是肠黏膜上皮细胞等的主要能源物质。谷氨酰胺也可以为淋巴细胞提供能源(Wu等，1991)且其对于淋巴细胞的增殖和功能发挥也是必不可少的（Field等，2002）。谷氨酰胺还可以增强巨噬细胞的吞噬活性、T淋巴细胞因子以及B淋巴细胞抗体的生成（Parrybillings等，1990；Field 等，2002）。人医上的Gln研究较早，De-Souza等（2005）研究发现谷氨酰胺能够保护肠道生理屏障，防止细菌移位，降低感染并发症，改善重危病人。肌内的谷氨酰胺水平在多种分解代谢状态下（例如：损伤、脓毒症和泌乳）会出现显著下降，且伴随着骨骼肌蛋白的负平衡（Curthoys等,1995）。Wu 等（1996）在饲粮中添加 1%的谷氨酰胺能够防止仔猪断奶后第一周内的空肠萎缩，其部分原因可能是mTOR信号途径的激活。因为亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸是动物体组织中（特别是骨骼肌）谷氨酰胺合成的底物（Wu等，2005），所以谷氨酰胺可能还具有部分调节支链氨基酸（BCAA）蛋白合成的作用。

谷氨酰胺不仅是蛋白质合成的前体物质，而且是许多代谢途径的中介物，是嘌呤、嘧啶和核酸等物质合成的前体和氮源的提供者。补充外源性谷氨酰胺，可增加受损肠道的血流量，直接提供代谢能源；促进胃黏膜黏液和前列腺素的分泌，促进肠道黏膜细胞修复，维护黏膜结构完整；增加局部肠道sIgA分泌；稳定肠道通透性，减少细菌移位（Ding等，2003）。由于谷氨酰胺在黏膜新陈代谢中的重要作用，认为这种必需氨基酸能够维护猪肠道屏障的完整及其功能。

3.2 精氨酸与仔猪肠道黏膜免疫

对于新生仔猪来说，精氨酸是一种必需氨基酸，适宜的精氨酸需要量能够促进新生仔猪的生长，且精氨酸是蛋白组织中丰富的氮运输者，能通过多种途径被利用（Wu等，2004a）。精氨酸还是多胺合成的重要前体物质，多胺通过调节DNA和蛋白质的合成，从而调节细胞增殖和分化（Igarashi等，2000），并在受损肠上皮的修复等过程中起着重要作用（Wu等，1998）。精氨酸作为一氧化氮的直接前体物，发挥着重要作用，而一氧化氮在调控肠道的分泌以及完整性方面扮演着重要角色（Morris等，2004）。

最近的研究指出精氨酸可以激活肠道上皮细胞mTOR和其他激酶介导的信号途径(Ban等,2004),从而刺激蛋白质合成、增强细胞迁移以及促使受损肠道上皮的修复。这可能为精氨酸在保护新生儿肠道完整性和功能方面的有益作用阐明了机理（Wu等，2004b）。

3.3 色氨酸和脯氨酸

色氨酸和脯氨酸在免疫功能方面的作用只有较少的报道。色氨酸的分解代谢似乎对巨噬细胞和淋巴细胞的功能发挥都是必不可少的，且口服色氨酸可以增强先天的免疫应答（Esteban等，2004）。促乳维生素（由吲哚胺2,3-双加氧酶途径生成的一种色氨酸的代谢产物）可以抑制辅助性T细胞Ⅰ型致炎细胞因子的产生和防止自身免疫性神经炎（Platten等，2005）。此外，肠道脯氨酸氧化酶的缺乏所引起的脯氨酸分解代谢的不足会损伤肠道免疫力（Ha等，2005）。其主要的调节物是来自脯氨酸氧化后的产物H2O2，H2O2对于病原菌是有细胞毒性的，同时其也是一种信号分子。

3.4 支链氨基酸与免疫

饲喂断奶仔猪以缺乏支链氨基酸（亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）的饲粮时，会导致抗体滴度下降，但对细胞免疫并不影响。当亮氨酸处于临界缺乏状态时，并未降低抗体滴度，却增加了细胞毒素的活性。Tischler等（1982）发现处于分解代谢状态的体外培养的骨骼肌中的亮氨酸可以刺激蛋白质合成并抑制蛋白质降解。此后，体内试验的研究发现在生理条件下，通过口服或日粮补充的形式使幼鼠和新生仔猪血浆中亮氨酸浓度升高的方法也会加强肌肉蛋白质的合成（Escobar等，2005；2006）。 此外，亮氨酸还可以激活小肠上皮细胞mTOR的信号途径（Ban等，2004），但它的功能性意义还未完全清楚。

4 结语

黏膜免疫系统构成了机体抵抗病原体入侵的第一道免疫屏障，肠道黏膜免疫在断奶仔猪免疫中起着重要作用，断奶仔猪任何日粮配方的设计需考虑胃肠道的发育以及日粮和肠道正常菌群之间的相互作用（Pluske等，2004）。从动物营养和饲料科学的角度，研究促进肠道黏膜免疫的营养物质并探讨其作用机理具有重要意义。因为消化、吸收过程和微生物对饲料成分的处理在满足断奶仔猪维持需要、生长发育和胃肠道健康方面有着重要的作用；而且从肠道免疫角度解决断奶仔猪腹泻、日粮抗原过敏应该有其独特的效果，完整有效的肠道保护体系可以保护上皮细胞的完整性，促进养分吸收，有望进一步提高养分利用率。但目前对断奶仔猪的肠黏膜免疫和营养调控还不深入，也没有确定一套能反映断奶仔猪肠道黏膜免疫功能的特异性指标。这些都有待于进一步深入研究。

39篇，刊略，需者可函索）