赤雹果水提物对佐剂性关节炎大鼠抗炎作用及机制研究*

佟继铭，赵 波，张玉玲

(承德医学院中药研究所，河北承德 067000）

赤雹果(Fruit ofThladiantha DubiBunge，FTDB)是葫芦科多年生蔓性草本植物赤雹的干燥成熟果实，为满族民间长期应用的药材，主要分布于华北、东北、内蒙等地区[1]。FTDB主要用于治疗腰腿痛、风湿痛、痛经、软组织损伤等，还具有较强的抗炎和抗过敏作用，且无明显的毒副作用，是具有巨大开发价值的抗炎镇痛药[2]。本文建立了与人类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA）类似的佐剂性关节炎(Adjuvant Arthritis，AA）大鼠模型，探讨赤雹果水提物的抗炎作用及机制，为将其开发成新的抗炎镇痛药物提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药物:赤雹果，2008年10月采自河北省青龙满族自治县，经承德医学院中药研究所赵春颖副研究员鉴定为葫芦科植物赤雹的成熟果实(保存于承德医学院中药研究所）;雷公藤多苷片，浙江得恩德制药有限公司，批号0809124;弗氏不完全佐剂(Freund’s incomplete adjuvant，FIA)，美国Sigma公司，批号:096K89031;卡介苗(bacillus calmetteand Guerin Vaccine，BCG）,卫生部北京生物制品研究所，批号:20080513;IL-1β(批号:EK0393）、IL-6(批号:EK0412）、TNF-α(批号:EK0526）ELISA 试剂盒，武汉博士德生物技术有限公司。

1.1.2 实验动物:SD大鼠，体重160-180g，雌雄各半购自河北医科大学实验动物中心，合格证号:903013。

1.1.3 实验仪器:DG3022A酶联免疫检测仪，第四军医大学国营华东电子管厂;BIX-311 CO2培养箱，日本TABAIESPEC;W-CJ-IF超净工作台，苏州净化设备厂;LD25-2低速自动平衡离心机，北京医用离心机厂;BX60 Olympus多功能显微镜，日本。

1.2 实验方法

1.2.1 AA大鼠模型的建立及实验动物分组:⑴弗氏完全佐剂(FCA）的制备[3]:同批号BCG 80℃水浴灭活1h，冷却后置玛瑙研磨器中研磨，用FIA配成BCG浓度为12mg/ml的FCA，震荡器中震荡超过30min充分乳化，4℃冰箱保存备用。⑵AA大鼠模型的制备[4]:临用前将FCA震荡混匀10min，大鼠右后足趾皮下注射0.1ml，每注射2只大鼠换一次针头及混匀后的FCA，正常大鼠注射等体积生理盐水。⑶实验动物分组及给药:SD大鼠80只，随机取10只做为正常对照组，其余70只均建立AA大鼠模型，将造模成功的AA大鼠随机分为模型组、赤雹果水提物(WFTD）高、中低(相当于提取物分别为3.2、1.6、0.8g/kg)剂量组和雷公藤(TP）阳性对照组，每组10只。于致炎后第1天，WFTD高、中、低剂量组大鼠分别灌胃给予不同剂量的WFTD(1次/d），TP阳性对照组给予雷公藤多苷12mg/kg/d;正常组和AA模型组大鼠分别给予等体积的生理盐水灌胃;各组均连续给药21天。

1.2.2 测量大鼠关节肿胀程度:采用排水法测量大鼠右后足跖体积，计算关节肿胀度。以致炎后第18天关节肿胀度为治疗前基础值，于给药后第21天，再次测定各组大鼠右后足跖体积。关节肿胀度(%）=(药后测量值-药前测量值）/药前测量值。

1.2.3 计算大鼠关节炎指数:于药前(致炎后第18天）及给药第21天，采用关节炎分数评分法记录继发性关节炎病变严重程度，计算关节炎指数AI值。0:无红肿，I:跖关节稍肿，Ⅱ:小趾关节及足跖关节肿胀，Ⅲ:踝关节以下足爪肿胀，Ⅳ:包括踝关节在内的全部关节肿胀。AI值=非致炎3只肢体关节肿胀级之和(I级为1分，总分为12分）。

1.2.4 检测血清中的炎性因子:给药第21天，摘眼球取血，分离血清。采用双抗夹心ABC-ELISA法，按试剂盒说明进行操作，检测血清IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。

1.3 统计分析 计量资料的组间比较采用方差分析，两两比较采用q检验。

2 结果

2.1 WFTD对AA大鼠关节肿胀程度的影响 见表1。治疗后，WFTD各剂量组及TP组大鼠关节肿胀程度明显轻于模型组(P＜0.01）。

2.2 WFTD对AA大鼠关节炎指数的影响 见表1。治疗后，WFTD各剂量组及TP组大鼠的关节炎指数明显低于模型组(P＜0.01）。

表1 各组大鼠关节肿胀程度和关节炎指数(±s，n=10）

表1 各组大鼠关节肿胀程度和关节炎指数(±s，n=10）

与模型组比较:*P＜0.01;与TP对照组比较:#P＜0.01

关节肿胀度 关节炎指数(AI）药前 药后 药前 药后AA模型组 - 0.44±0.07 0.62±0.10 5.70±0.82 7.00±1.05 WFTD 高 3.2 0.43±1.43 0.27±0.04* 5.40±1.43 4.20±1.03*WFTD 中 1.6 0.43±0.03 0.32±0.06* 5.30±1.25 5.00±0.82*WFTD 低 0.8 0.45±0.04 0.38±0.05*# 5.60±1.26 5.60±0.70*#TP 对照组 0.012 0.42±0.05 0.29±0.04* 5.40±0.84 4.60±0.70*组别 剂量(g/kg）

2.3 WFTD对AA大鼠血清炎性细胞因子水平的影响模型组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平明显高于正常组(P＜0.01）。各给药组大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平显著低于模型组(P＜0.01）。见表2。

表2 各组大鼠血清炎性因子的水平(±s，n=10）

表2 各组大鼠血清炎性因子的水平(±s，n=10）

与模型组比较:*P＜0.01;与正常组比较:##P＜0.05,#P＜0.01

组别 剂量(g/kg） IL-1β(ng/ml） IL-6(pg/ml） TNF-α(ng/ml）正常组 - 0.11±0.01* 0.75±0.02* 0.17±0.01*AA模型组 - 0.49±0.01 1.58±0.04 1.24±0.06 WFTD 高 3.2 0.15±0.01*# 0.80±0.03*# 0.19±0.01*WFTD 中 1.6 0.22±0.01*# 0.99±0.03*# 0.28±0.01*#WFTD 低 0.8 0.32±0.01*# 1.16±0.04*# 0.34±0.01*#TP对照组 0.012 0.14±0.01*# 0.82±0.04*# 0.20±0.01*##

3 讨论

类风湿性关节炎是一种以慢性多发性关节炎为主要表现的全身性自身免疫性疾病，其中细胞免疫的作用越来越受到重视。近年的研究表明，诸多免疫细胞及其所分泌的细胞因子(CK)参与了这一病理过程，CK间的相互作用失去平衡从而导致免疫病理损伤[5]。RA患者关节腔内的巨噬细胞大量分泌IL-1β和TNF-α，使外周血和关节滑膜液中IL-1β、TNF-α明显增高。IL-1β、TNF-α在RA发病中的作用主要表现在对免疫和炎症细胞的局部作用:①激活血管内皮细胞，增强内皮细胞黏附分子的表达，趋化血液中的粒细胞等炎细胞进入关节腔。②刺激滑膜纤维母细胞和软骨细胞产生前列腺素E等小分子炎症介质。③通过刺激滑膜细胞和软骨细胞，使破骨细胞减少糖蛋白合成，增加糖蛋白降解，并产生胶原酶和其它中性蛋白酶，导致关节软骨和骨组织破坏[6]。IL-1β能直接或间接刺激纤维母细胞增殖介导关节瘢痕的产生和纤维化，TNF-α增加了IL-1β介导的实验性滑膜炎的组织损伤。IL-6不仅能增加IL-1β和TNF-α的效应，还能促进类风湿因子形成，滑液中的IL-6作为一种潜在的破骨样细胞增长的刺激因子可导致关节软骨的破坏性病变[7]。AA大鼠模型是用FCA免疫敏感种系大鼠所诱发的一种发病机制和病理特征与人类RA相似的动物多发性关节炎模型。本研究结果表明，高、中、低剂量的WFTD均能明显改善AA大鼠关节及关节外炎性症状，使关节肿胀度和关节炎炎性指数显著下降。AA大鼠血清IL-1β、IL-6及TNF-α水平较正常对照组显著升高，WFTD治疗后，各炎性因子水平明显降低，提示WFTD具有良好的抗炎作用。

综上所述,WFTD对AA大鼠具有明显的治疗作用，其作用机制可能与调节机体异常的免疫功能和维持细胞因子平衡有关。本研究可为将赤雹果开发为治疗人RA的新药提供依据。

[1]宋立人，红恂，丁绪亮，等.现代中药大辞典[M].上册.北京:人民卫生出版社，2001.1022.

[2]佟继铭，李兰芳，宋利萍，等.满药赤雹果水溶性提取物镇痛作用的研究[J].承德医学院学报，2006,23(4):337-339.

[3]夏伦祝,徐先祥,张睿.威灵仙总皂苷对大鼠佐剂性关节炎抗炎作用的研究[J].安徽医药,2009,13(4):363-365.

[4]徐淑云.药理实验方法学[M].第3版.北京:人民卫生出版社,2003.906.

[5]程惠丽.Th1/Th2细胞因子平衡与类风湿关节炎的研究进展[J].吉林医学,2006,27(3):334-336.

[6]Yong J,Kim HY,Park JH,et al.Regulation of TNF-alph mediated hyperplasia through TNF receptors TRAFS i synoviocytes obtained from patients with rheumatoi arthritis[J]. Immunol Lett,2002,83(2):85-93.

[7]Odeh M.New insight into the pathogenesis and treatmen of rheumatoid arthritis[J].Clin Immunol Immunopa thol,1997,83(2):103-109.