热疗对人肝癌HepG2细胞凋亡的影响

李素杰，周 瑾，王海松，马胜辉，龚明玉(.承德医学院临床医学系007级，河北承德 067000;.承德市中心医院肿瘤外科;.指导教师）

原发性肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，在各种恶性肿瘤的死亡顺序中居第二位，每年死亡20多万人，约占世界肝癌死亡人数的一半以上[1]。恶性肿瘤的发生、发展的过程，是细胞的过度增殖和细胞凋亡受到抑制的过程[2]。诱导细胞凋亡已成为治疗肿瘤的一个新热点。应用加热治疗肿瘤早已被临床所接受，但加热对肝癌HepG2细胞凋亡的影响未见报道。为此，我们以肝癌HepG2细胞为模型，观察不同加热时间对肝癌HepG2细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 细胞与培养 人肝癌细胞株HepG2:购自南京凯基生物科技有限公司，为单层贴壁生长。培养液为RPMI1640培养基(GIBCO公司产品），内含10%新生牛血清，100u/ml青霉素，100μg/ml链霉素。将HepG2细胞置于37℃，5%CO2培养箱内培养至指数生长期进行实验，隔2-3d传代一次，细胞消化液为0.25%的胰酶。

1.2 细胞处理及分组 取生长状态良好的HepG2细胞若干瓶，采用随机对照原则分为对照组和实验组。(1）对照组:即加热0h组(正常培养的HepG2细胞）;(2）实验组:根据加热时间不同分为3组:即加热0.5h组、加热1h组、加热1.5h组。将恒温水浴箱调至所需温度43℃对细胞进行加热，实验组细胞热疗后，弃上清，加入5ml新鲜培养基，置37℃继续培养24h。

1.3 膜联蛋白(Annexin-V-EGFP）流式细胞仪检测 用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化收集上述对照组及不同加热时间处理组细胞(约5×105），PBS洗2遍，1500rpm、4℃、5min收集细胞，弃上清，加入500μl的Bingding Buffer悬浮细胞，加入5μl Annexin-V-EGFP及5μlPI混匀后，室温避光反应15min，采用流式细胞仪检测心肌细胞膜PS外翻的情况， 用Muticycle软件分析计算凋亡心肌细胞的百分比。结果判定:Annexin V-/PI-为正常细胞，AnnexinⅤ+/PI-为凋亡细胞，Annexin V+/PI+为坏死细胞，实验重复3次，取均数。

2 结果

膜联蛋白(Annexin-Ⅴ-EGFP）流式细胞仪检测各组HepG2细胞的凋亡情况:Annexin-Ⅴ是一种细胞膜磷脂酰丝氨酸(PS）亲和蛋白，经EGFP荧光标记后的荧光强度反映细胞膜的PS密度，进而反映细胞凋亡率。经流式细胞仪检测对照组HepG2细胞凋亡率仅为13.23，加温处理组细胞凋亡率为20.07、25.52、32.83，实验组与对照组相比，细胞凋亡率明显增加(P＜0.01），随着加热时间的延长，细胞凋亡率增加。提示加热可诱导肝癌HepG2细胞凋亡，且凋亡情况与加热时间有关见附表。

附表 不同加热时间对HepG2细胞凋亡的影响(±S）

附表 不同加热时间对HepG2细胞凋亡的影响(±S）

与对照组比较:▲P＜0.01

组别 n 细胞凋亡率(%）对照组 8 13.23±1.89加热0.5h组 8 20.07±4.50▲加热1.0h组 8 25.52±2.70▲加热1.5h组 8 32.83±4.93▲

3 讨论

肿瘤热疗已成为继手术、放疗、化疗之后的一种全新的治疗肿瘤的“绿色疗法”。肿瘤热疗即利用有关物理能量在组织中沉淀而产生热效应，使肿瘤组织温度上升到有效治疗温度，并维持一段时间以杀死癌细胞，又不损伤正常细胞的一种治疗方法。热对细胞的杀伤作用是由于热可以引起蛋白质的变性和细胞结构及功能的损害，热疗可以长时间抑制DNA的合成[3]。体外研究表明，热疗通常存在一个临界温度，在临界温度以下热诱导细胞凋亡为热作用的主要机制，而临界温度以上则主要引起细胞坏死[4]。热疗能增加肿瘤细胞的血流速度和细胞代谢，这样能使更多的化疗药物、放射剂量、基因的靶向治疗作用于肿瘤细胞能更加有效的控制肿瘤[5]。本实验采用43℃水浴不同的加热时间处理细胞，用Annexin-Ⅴ-EGFP流式细胞仪检测各组HepG2细胞的凋亡情况。结果发现，对照组HepG细胞凋亡率仅为13.23，加温处理组细胞凋亡率为20.0、25.52、32.83。实验组与对照组相比:细胞凋亡率明显增加(P＜0.01），随着加热时间的延长，细胞凋亡率增加。提示加热可诱导肝癌HepG2细胞凋亡，且凋亡情况与加热时间有关。流式细胞仪是目前定量检测细胞凋亡的常用方法，常用于检测因DNA损伤而引起的细胞凋亡[6]。本实验为临床应用热疗治疗肿瘤提供了一定的实验依据，但热疗具体通过何种途径诱导细胞凋亡有待进一步研究。

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