穿山龙总皂苷对CIA大鼠滑膜血管新生的作用*

董文娟，梁秀军，翟泽玲，宋鸿儒

(承德医学院，河北承德 067000）

类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA）是常见、多发的免疫性疾病，主要侵犯关节滑膜，表现为多发性、进行性滑膜炎，病理特征为滑膜细胞增生、血管新生增多、血管翳形成等。血管内皮生长因子(VEGF）是促进血管生成的特异性因子，与血管新生有关。穿山龙民间多用于治疗风湿病、冠心病、腰腿疼痛等症[1]。本实验拟通过检测胶原诱导性关节炎(collageninduced arthritis，CIA）大鼠滑膜组织MVD和VEGF的表达与变化情况，观察穿山龙总皂苷对CIA大鼠滑膜血管新生的作用，并探讨作用机理，为穿山龙治疗RA提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级雌性Wistar大鼠42只，实验起始体重(140±20）g，购于北京维通利华实验动物有限公司，合格证号:0158513。

1.2 主要试剂及设备 牛Ⅱ型胶原，美国Chondrex公司;弗氏完全佐剂(CFA），美国Sigma公司。山羊抗大鼠CD31多克隆抗体，美国Santa公司;兔抗大鼠VEGF多克隆抗体，美国Thermo公司;免疫组织化学试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司。穿山龙总皂苷，承德医学院中药研究所提取;雷公藤多甙片，黄石飞云制药有限公司;薯蓣皂苷元，南京泽朗医药科技有限公司。

1.3 模型制备及模型成功的判断标准[2-3]将溶于醋酸的牛Ⅱ型胶原(2mg/ml）与CFA等体积混合、乳化，制成Ⅱ型胶原乳剂。无菌条件下，在大鼠背部及尾根部多点注射(每只0.2ml），第7d相同剂量加强一次，作为激发注射。用关节炎指数(AI）作为判断模型是否成功的标准。肢体关节肿胀按0-Ⅳ级评分:0，无红肿;Ⅰ，趾关节稍肿;Ⅱ，趾关节及足趾关节肿胀;Ⅲ，踝关节以下足爪肿胀;Ⅳ，包括踝关节在内的全部足爪肿胀。AI值=四肢肢体关节肿胀级评分之和(0级为0分，Ⅰ级为1分，Ⅱ级为2分，Ⅲ级为3分，Ⅳ级为分，总分为16分）。AI值≥4分为造模成功。

1.4 实验动物分组及给药 42只Wistar大鼠，随机取6只做为正常对照组(A组），按1.3的方法注射等量生理盐水;其余36只大鼠待成功建立CIA模型后随机分组:CIA模型组(B组）、雷公藤组(C组）、穿山龙总皂苷高剂量组(D组）、穿山龙总皂苷中剂量组(E组）、穿山龙总皂苷低剂量组(F组）、薯蓣皂苷元组(G组），每组6只大鼠。致炎后第14d起，B组大鼠不再做任何处理，C组大鼠给予雷公藤多甙片(12mg/kg/d灌胃，D组、E组、F组大鼠分别给予不同剂量的穿山龙总皂苷(100、50、25mg/kg/d）灌胃，G 组大鼠给予薯蓣皂苷元(50mg/kg/d）灌胃，各组用药时间均为2天。

1.5 大鼠一般状态的观察 于造模前后观察大鼠的饮食、毛色，神志、活动状态及关节红肿情况。

1.6 关节滑膜MVD及VEGF表达的检测 灌胃治疗21d后，各组大鼠断头处死，取双侧膝关节滑膜置于10%中性甲醛中固定，常规石蜡包埋、切片，片厚5μm。

1.6.1 检测关节滑膜MVD:SP免疫组织化学染色法，山羊抗大鼠CD31多克隆抗体标记血管内皮细胞(一抗稀释浓度1:50），DAB显色、苏木素复染。每只大鼠选取6张切片，每张切片先在低倍镜下找出三个血管密度最高的区域，然后在高倍镜(400倍）下计数这三个区域的微血管数，取平均值[4]。

1.6.2 检测关节滑膜VEGF的表达:SABC免疫组织化学染色法，一抗稀释浓度为1:50。VEGF定位于细胞浆，以细胞浆呈棕黄色为阳性细胞。采用MiVnt图像分析系统在400倍显微镜下对免疫组化阳性结果进行定量分析，以免疫阳性产物面积占视野面积的比值作为VEGF蛋白的相对表达水平。每只大鼠选取6张切片，每张切片观察3个视野，取平均值。

1.7 统计分析 采用SPSS 11.5软件包进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s）表示，组间比较用方差分析，方差不齐用秩和检验。

2 结果

2.1 各组大鼠一般状态及四肢关节局部病变情况 大鼠初次免疫注射后，背部及尾根部形成多处小溃疡，被毛无光泽;第12d后，后足部出现明显肿胀，发红;以后逐渐累及后肢膝关节及前肢。A组大鼠在整个实验期间饮食正常，精神状态好，被毛有光泽，四肢关节无明显变化。B组大鼠进食减少，精神萎靡，四肢关节持续肿胀，且足爪出现畸形，行动不便。药物治疗后，C、D、E、F、G组大鼠与B组大鼠相比，上述症状均有不同程度减轻。

2.2 关节滑膜微血管MVD检测结果 B组大鼠滑膜组织血管丰富，新生血管数量较多且密集，MVD明显大于A组(P＜0.01）。与B组大鼠相比，各治疗组大鼠的MVD明显降低(P＜0.01）;各治疗组间比较无显著差异(P＞0.05）。见附表。

附表 各组大鼠关节滑膜MVD和VEGF的表达(±s，n=6）

附表 各组大鼠关节滑膜MVD和VEGF的表达(±s，n=6）

与A组比较:▲P＜0.01，与B组比较:★P＜0.01

group MVD VEGF A 3.00±0.71 0.0014±0.0002 B 9.20±1.30▲ 0.1167±0.0207▲C 5.00±0.82▲★ 0.0420±0.0057▲★D 5.75±0.96▲★ 0.0351±0.0096▲★E 5.00±0.82▲★ 0.0321±0.0023▲★F 4.80±0.45▲★ 0.0452±0.0078▲★G 5.20±0.84▲★ 0.0397±0.0076▲★

2.3 关节滑膜VEGF的表达 B组(模型组）大鼠关节滑膜VEGF的表达明显高于A组(P＜0.01）。C、D、E、F、G组大鼠关节滑膜VEGF的表达明显低于B组(P＜0.01）;各组治疗组间比较无显著性差异(P＞0.05）。见附表。

3 讨论

研究表明，血管新生和血管翳形成在RA的发生发展中具有重要作用。随着病情发展，血管增生、炎性细胞浸润，对软骨和骨组织侵蚀，破坏关节正常组织结构。许多因子参与了RA血管新生的过程，VEGF是促进血管生成的特异性因子。VEGF及其受体在血管新生中起着最关键的作用，可调控内皮细胞的增殖、迁移、管腔形成等重要环节[5]。VEGF通过与其特异性受体Flt-1和KDR/Flk-1作用，促进血管内皮细胞的有丝分裂，从而促进新生血管的形成。研究发现，关节组织VEGF及其受体Flt-1和KDR/Flk-1的表达强弱与关节炎的严重程度和血管新生关系密切，提示VEGF在CIA的发展中调控了血管的发生[6]。本研究亦发现，模型组大鼠滑膜MVD和VEGF表达高于正常组，与文献报道一致。

穿山龙是薯蓣科薯蓣属植物穿龙薯蓣的根茎，有效成分主要为甾体皂苷类，有多种药理作用，能祛风除湿、舒筋活血、止咳化痰。本课题组的前期研究发现，穿山龙对佐剂性关节炎具有治疗作用，能缓解大鼠关节肿胀等炎症反应，减轻滑膜炎性细胞浸润和滑膜组织增生等病理改变[7]。本研究进一步观察了穿山龙总皂苷对CIA大鼠滑膜血管新生和VEGF表达的影响。本研究发现，与模型组比较，各治疗组大鼠滑膜MVD和VEGF水平明显降低(P＜0.01），且各治疗组间比较无显著差异(P＞0.05）。本研究表明，穿山龙总皂苷可能通过抑制CIA大鼠滑膜VEGF的异常表达，减轻血管新生，减轻炎症反应，但穿山龙总皂苷中具体哪种成分对CIA起治疗作用尚待进一步研究。

[1]王本祥.现代中药药理学[M].天津:天津科学技术出版社，1999.427，817.

[2]朱蕾，魏伟.白芍总苷对大鼠胶原性关节炎及其免疫功能的影响[J].中国药学杂志，2007，42(20):1547-1551.

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[4]张育，周玮，顾健，等.沙利度胺及氨甲喋呤抗CIA大鼠滑膜血管新生及其作用机制的研究[J].实用临床医药杂志，2008，12(5):23-27，32.

[5]Garrato A,Galleqo-plazas J,Guillen-ponce C.Anti-VEGF therapy:a new approach to colorectal cancer therapy[J].Expert Rev Anticancer Ther,2006,6(10):1385-1396.

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[7]谢守军，宋鸿儒.穿山龙总皂苷对佐剂性关节炎大鼠免疫调节作用的实验研究[J].辽宁中医杂志，2007，34(9):1323-1325.