黄芩苷对小鼠肠道菌群影响的量-时规律观察

罗海燕 宋姗姗 黄暨生 孙冬梅 刘素香 邝枣园*

广东省广州中医药大学基础医学院（510006）

人体体表、与外界相通的腔道内存在大量并不致病的微生物群，尤其是肠道内更是寄居着种类繁多的微生物，这些微生物统称为肠道菌群。这些微生物群对其宿主非但无害，而且有益，具有促进营养吸收、抗衰老、抗肿瘤等众多的生理效应，这是正常微生物群与其宿主长期共生的进化结果。

根据中医理论，过量或长期服用苦寒的清热解毒的中药将损伤脾胃、耗伤正气，提出苦寒伤胃理论，邱赛红等[1]从胃肠运动、肝肾功能和胃肠激素[2]等角度研究了多种苦寒中药的伤胃内涵。本课题组自2007年开始从肠道微生态角度研究苦寒药的伤胃机制，我们的研究发现黄连解毒汤在一定浓度下可抑制双歧杆菌和乳酸杆菌的生长，显示一定的抑制益生菌的作用的不良现象。同时，在较低浓度时尚可抑制条件致病菌的生长[3]。而从清热解毒药提取的有效成分是否也具有“伤胃”作用则未见报道。

故本研究在前期研究的基础上，观察了黄芩苷对肠道四种菌的影响，同时欲观察其浓度和作用时间对肠道细菌的影响规律，以期为临床合理使用黄芩苷提供参考资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

SPF级昆明种小鼠，雌雄各半，体质量18～22g，由广东省实验动物中心提供，实验动物合格证号：SCXK（粤）2008-0002；实验动物质量合格证号：粤监证字2008A022。

表1 黄芩苷对小鼠体质量的影响（±s）

表1 黄芩苷对小鼠体质量的影响（±s）

注：※与正常组比较，其中※表示P＜0.05，※※表示P＜0.01

组别 N 第1天 第3天 第6天 第9天 第14天正常组 8 21.38±0.86 24.10±0.55 25.04±0.35 27.65±0.97 29.99±0.73抗生素组 8 20.55±0.87 23.70±0.67 24.53±0.61 25.41±0.93※※ 26.64±1.30※※黄芩苷低剂量 8 20.81±1.14 23.95±1.02 25.20±0.81 27.89±0.88 30.16±0.94黄芩苷中剂量 8 21.11±0.69 23.59±0.64 24.51±0.47 26.24±0.42※ 29.41±0.69黄芩苷高剂量 8 20.91±1.28 23.30±1.13 24.36±0.97 25.49±1.13※※ 27.65±1.04※※

表2 不同处理因素下四种细菌数量变化（±s，N=8）

表2 不同处理因素下四种细菌数量变化（±s，N=8）

注：※与正常组比较，其中※表示P＜0.05，※※表示P＜0.01

分组 3天 6天 9天 14天大肠埃希菌正常组 8.25±0.27 8.16±0.30 8.19±0.07 8.18±0.85林可霉素组 8.43±0.47 8.62±0.59 8.83±0.24※ 9.39±0.16※※黄芩苷低剂量 8.13±0.58 9.39±0.31※※ 9.00±0.44※※ 9.40±0.21※※黄芩苷中剂量 8.35±0.54 7.77±0.50 7.95±0.62 9.10±0.17※※黄芩苷高剂量 9.14±0.72※ 8.87±0.56 9.14±0.20※※ 9.04±0.43※※粪肠球菌正常组 8.48±0.21 8.10±0.52 8.44±0.79 8.45±0.42林可霉素组 8.29±0.61 9.17±0.27 9.50±0.17※※ 9.65±0.14※※黄芩苷低剂量 8.26±0.26 8.56±0.76 7.85±0.16※ 8.18±0.52黄芩苷中剂量 7.44±0.28※※ 6.77±0.49※※ 8.19±0.41 7.73±0.43※※黄芩苷高剂量 7.61±0.34※※ 7.99±0.73 8.61±0.43 9.12±0.30※双歧杆菌正常组 9.31±0.14 9.26±0.78 9.36±0.08 9.35±0.67林可霉素组 9.04±0.42 8.96±0.31 8.93±0.20※ 8.61±0.29※※黄芩苷低剂量 9.06±0.32 9.23±0.53 9.33±0.15 9.42±0.16黄芩苷中剂量 9.02±0.21 9.26±0.20 9.12±0.27 9.40±0.29黄芩苷高剂量 9.38±0.24 8.96±0.35 8.88±0.36※※ 8.87±0.23※※正常组 9.29±0.22 9.21±0.25 9.25±0.57 9.32±0.36林可霉素组 8.91±0.32 8.72±0.26※ 8.63±0.45※ 8.30±0.55※※黄芩苷低剂量 8.80±0.39 9.25±0.28 9.21±0.13 9.41±0.33黄芩苷中剂量 9.22±0.43 9.30±0.20 8.97±0.11 9.22±0.23黄芩苷高剂量 9.45±0.23 8.69±0.55※※ 8.95±0.13 8.73±0.29※乳酸杆菌

1.1.2 药物与试剂

盐酸林可霉素注射液（上海现代哈森药业有限公司，2mL/支，300mg/mL，国药准字H41021941）、黄芩苷（纯度＞98%，南京青泽医药科技开发有限公司）。

1.1.3 培养基

MRSA培养基、BS培养基、粪肠球菌琼脂、麦康凯培养基、BHI培养基，由青岛高科园海博生物技术有限公司出品。

1.1.4 主要设备

YXQ-LS-50SⅡ立式压力蒸汽灭菌器、超净工作台、旋转蒸发仪、AE1-160电子天平、PV-1漩涡混匀器、金花加样器、PYX-DHS-50×65-BS-Ⅱ隔水式电热恒温培养箱、825-A型厌氧菌培养罐、BX51型荧光明场数码显微镜。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及给药

取昆明种小鼠，随机分为5组：正常组、抗生素组、黄芩苷高剂量组、黄芩苷中剂量组和黄芩苷低剂量组。抗生素组，给予盐酸林可霉素灌胃，120mg/d；黄芩苷高剂量组给予黄芩苷灌胃，100mg/（kg·d）；黄芩苷中剂量组给予黄芩苷灌胃，50mg/（kg·d）；黄芩苷低剂量组给与黄芩苷灌胃，25mg/（kg·d），正常组给予生理盐水灌胃，0.4mL/d。每晚8时后禁食，次日9时灌胃后供给足量饲料。

1.2.2 形态行为观察

每天观察和记录各组小鼠外形、活动、饮食、排便情况，实验进行第1、3、6、9、14天称量和记录小鼠体质量。

1.2.3 肠道菌群分析

每组于第3、6、9、14天取8只将小鼠断椎处死，常规消毒后正中剪开腹腔，找出回盲部，无菌手法取出盲肠内容物涂于洁净玻片上，革兰染色后镜检计数球菌和杆菌的比例，另取盲肠内容物0.1g，置于装有玻璃珠的无菌试管内，加0.9mL生理盐水，于震荡器上震荡15min，使盲肠内容物均质化。将上述震荡好的标本进行10倍系列稀释至106。选用10-4、10-5、10-6，以灭菌吸头，自高稀释度向低稀释度在相应的培养基上各滴加50μL稀释液，待滴种好的培养基吸干后，放入37℃ 温箱中培养。其中MRSA培养基（分离乳酸杆菌）厌氧培养48h，BS 培养基（分离双歧杆菌）厌氧培养72h、肠球菌琼脂（分离肠球菌）需氧培养24h、麦康凯培养基（分离肠杆菌）需氧培养24h。待菌落长出后，以菌落形态、革兰染色、生化反应鉴定所需目的菌。培养好的细菌经鉴定后计算每克盲肠内容物中的细菌数量，即CFU/g标本。选择菌落适中的稀释度，算出同一稀释度平均菌落数（X）。

公式：CFU/g标本=X/0.05×稀释倍数×1/标本重量（g）。结果用常用对数值1gCFU/g表示。

2 结 果

2.1 各组表征变化

正常组小鼠饮食正常，行动活跃，被毛平整光滑，粪便正常。抗生素组小鼠随着实验时间增加，摄食量下降，精神萎靡，行动迟缓，被毛无光泽，畏寒扎堆，大便稀湿等表现越来越明显。高剂量黄芩苷组小鼠摄食量亦下降，行动较迟缓，被毛无光泽，大便稀湿，随着实验时间增加，和抗生素组小鼠表征相似。中剂量黄芩苷组，3、6d时和正常组小鼠表征接近，九天组时开始出现摄食量稍下降，行动较迟缓，粪便较稀释等现象，但变化没有高剂量黄芩苷组明显。低剂量黄芩苷组随着实验时间的增加小鼠表征无明显变化，饮食正常，行动活跃，被毛平整光滑，粪便正常。

2.2 体质量变化

抗生素组，高剂量黄芩苷组小鼠体质量增长缓慢，于第9天和第14天时该两组小鼠体质量均小于正常组，差别有显著意义（P＜0.01）。低剂量黄芩苷组小鼠体质量和正常组比较，在第9天时体质量少，第14天时和正常组比较无差异，见表1。

2.3 肠道菌群变化

我们分别观察了4种菌4个时间点的情况，见表2，现分述如下：

2.3.1 大肠杆菌

抗生素组第9、14天出现大肠杆菌升高，4个时间点呈上升趋势；黄芩苷高剂量第3天开始出现大肠杆菌升高；黄芩苷中剂量第14天大肠杆菌升高；黄芩苷低剂量组第6天开始出现大肠杆菌升高，黄芩苷各组4个间点变化均波动，无明显上升或降低趋势，见表2。

2.3.2 粪肠球菌

抗生素组第9、14天出现肠球菌升高，4个间点呈上升趋势；黄芩苷高剂量第3天开始肠球菌降低，4个间点出现先降后升趋势，中剂量和低剂量黄芩苷组肠球菌减少，4个间点也是先降后升。

2.3.3 双歧杆菌

抗生素组第9、14天出现下降，4个间点呈明显下降趋势；黄芩苷高剂量组也在第9、14天双歧杆菌下降，4个间点呈明显下降趋势；黄芩苷中、低剂量组双歧杆菌与正常组比较差别无统计学意义，4个间点呈波动。

2.3.4 乳酸杆菌

抗生素组第9、14天出现乳酸杆菌下降；黄芩苷高剂量第6天出现乳酸杆菌下降，4个间点波动；中、低剂量黄芩苷对乳酸杆菌无影响，4个间点变化波动。

综上所述，我们可以看到林可霉素对各种菌的影响变化比较有规律，均在第9和14天出现变化，出现乳酸杆菌和双歧杆菌减少，大肠杆菌和肠球菌增加，4个间点的变化规律也较明显，大肠杆菌和肠球菌呈上升趋势，乳酸杆菌和双歧杆菌呈下降趋势。黄芩苷对各种菌的影响变化则较复杂，出现变化的时间点有些提前到第3天，有些推迟到第14天，中、低剂量黄芩苷对乳酸杆菌和双歧杆菌无影响，但可升高大肠杆菌含量，降低粪肠球菌含量，高剂量黄芩苷可降低双歧杆菌和乳酸杆菌含量，升高大肠杆菌，降低粪肠球菌。黄芩苷对肠球菌的影响与林可霉素恰好相反。

4个间点的变化除肠球菌出现先降后升外，其他各组均较波动，无明显的上升或下降趋势。

3 讨 论

本研究显示林可霉素造成的菌群失调，主要出现在用药的第9和14天，出现益生菌乳酸杆菌和双歧杆菌的下降，大肠杆菌和肠球菌的升高，出现了典型的菌群失调现象，且菌群的变化有明显的量-时规律，说明该药可以作为良好的菌群失调模型和对照。

黄芩苷高剂量组也出现益生菌的减少，说明清热解毒药黄芩的提取物在一定浓度也会造成菌群失调，其出现菌群失调的时间与林可霉素类似，提示临床使用该药剂量和用量的选择需慎重，也说明黄芩苷可能是黄芩造成菌群失调的物质基础之一。

有趣的研究结果是，与黄连解毒汤的研究[3]类似，我们也观察到黄芩苷在中、低剂量使用时出现条件致病菌粪肠球菌的减少，这点与林可霉素不一致（林可霉素可使粪肠球菌升高）。肠球菌属目前被认为是医院感染的常见致病菌，通常引起尿道感染、伤口感染、菌血症等，主要见于免疫力低下或过量使用抗生素的患者[4]，也可导致败血症、心内膜炎等危及生命，病死率达21.0%～27.5%[5]。肠球菌种类很多，其中粪肠球菌最为常见。本研究发现一定浓度的黄芩苷可抑制粪肠球菌的生长，提示黄芩苷可能在治疗粪肠球菌感染中起到一定作用。

[1]邱赛红,李飞艳,尹健康等.9味苦寒药对小鼠胃肠运动与肝肾功能影响的实验研究[J].湖南中医学院学报,2004,24(5)：1-6.

[2]李飞艳,邱赛红,尹健康等.常用苦寒药对大鼠胃肠激素影响的研究[J].湖南中医学院学报,2007,27(1)：9-11.

[3]罗海华,董姝,张晟等.黄连解毒汤对小鼠肠道菌群的影响[J].热带医学杂志,2009,9(4)：367-371.

[4]Olesen HV,Moller JK.Enterococcal infection： clinical findings and treatment considering antibiotic resistance in Denmar[J].Ugeskr Laeger,2002,163(18)：2386-2390.

[5]Sanchez-silos RM,Perez-Giraldo C.Pathogenicity of enterococcus spp. Characteristics of 169 hospital isolates[J].Enferm Infection Microbiol Clin,2000,18(4)：165-169.