结核分枝杆菌Rv0341蛋白编码基因iniB的多态性分析

吴园 胡频频 王易伟 李秀全 毛旭虎 钟敏,4

(1.解放军第二五四医院检验科 天津 300142;2.第三军医大学医学检验系临床微生物及免疫学教研室暨重庆市生物制药工程技术研究中心 重庆 400038;3.重庆市结核基因诊断中心实验室 重庆 400020;4.重庆市公共卫生医疗救治中心 重庆 400036)

结核分枝杆菌存在一种特殊的生长状态—依赖利福平(R)生长即依赖利福平结核分枝杆菌(依R菌)在适宜的R浓度下生长旺盛,无R生长不良或不能生长。依R菌感染所致肺结核患者具有病情重、耐多药(74.4%～100%)、化疗效果差和预后不良的临床特征,比一般的耐药病例危害更大。该类结核病如果再使用利福平,不但会导致化疗失败,而且可使病情恶化,是难治性结核病的产生和化疗失败的重要原因之一[1]。

在对依R菌的研究中发现：结核分枝杆菌假设蛋白Rv0341的高表达与依 R菌结核病密切相关,可视为依R菌的相关蛋白或标志物,可用于诊断依赖利福平结核分枝杆菌结核病(其蛋白2009年6月已获得国家发明专利,专利号：200510057486.3)。

该研究拟通过对结核分枝杆菌假设蛋白Rv0341编码基因iniB限制性片段长度的多态性分析,确认基因的保守性,为依R菌结核病临床血清学快速诊断和试剂盒的研发奠定基础,并探讨依R菌在利福平培养管中Rv0341高表达的可能原因,为阐明依R菌的产生机制及依R菌结核病的有效防治提供帮助。

1 资料和方法

1.1 材料 依 R菌(14株)、耐 R菌(23株)、R敏感的结核分枝杆菌(12株)、结核分枝杆菌H37Rv、BCG及大肠埃希菌等灭活菌株,由重庆市结核基因诊断中心实验室提供;LA-Taq with GC Buffer DNA聚合酶、限制性内切酶ApaⅠ、EcoRⅤ、KpnⅠ、SmaⅠ为 TAKARA公司产品;细菌基因组DNA基因组提取试剂盒(离心柱型)为天根生化科技(北京)有限公司产品;核酸回收试剂盒为OMEGA公司产品;DNA MakerⅦ、100 bp DNA Maker为北京天为时代科技有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 细菌基因组DNA提取大肠埃希菌、51株结核分枝杆菌培养物经巴氏水浴1 h以上,无菌刮取培养物于高压灭菌的EP管中,提取方法参照细菌基因组DNA提取试剂盒产品说明书。

1.2.2 iniB基因的扩增 用软件Primer Premier 5.0设计引物(引物由上海生工合成)：上游引物5′-ATGACCTCGCT TATCGATTAC-3′;下 游 引 物5′-TCAGAACCCGGGTAGTCCGAAAA-3′。 PCR反应体系：LA-Taq with GC Buffer DNA聚合酶0.25 μ l,GC rich BufferⅠ 12.5 μ l,dNTP 4 μ l,上下游引物各 0.5 μ l,DNA 模板 4 μ l,双蒸水 3.25 μ l。PCR反应条件如下：94℃预变性5 min;94℃50 s,55℃45 s,72℃1 min 30 s,30个循环;最后72℃延伸10 min。回收PCR产物中1440 bp大小的目的片段,操作参照核酸回收试剂盒说明书。

1.2.3 iniB基因的测序随机抽取20个目的片段送上海英骏生物技术有限公司测序。

1.3 RFLP分析 对目的片段分别进行2组双酶切：(1)ApaⅠ和EcoRⅤ双酶切反应体系：PCR产物 4 μ l,Apa Ⅰ 0.5 μ l,10 ×L Buffer 1 μ l,补双蒸水至10 μ l,37℃酶切 1 h,之后 65℃灭活 ApaⅠ20 min,在体系中继续加入10×H Buffer 1μ l,EcoRⅤ 0.5μ l,补双蒸水至20 μ l,37 ℃酶切1 h;(2)KpnⅠ和SmaⅠ双酶切反应体系：PCR产物5μ l,限制性内切酶均为 0.7 μ l,10 ×T Buffer 1 μ l,BSA 1 μ l,补双蒸水至10 μ l,37℃酶切1 h。酶切后1%琼脂糖凝胶电泳检测其带型。

2 结果

2.1 限制性内切酶对目的片段的酶切分析 ApaⅠ 、EcoRⅤ、KpnⅠ 、SmaⅠ在iniB 基因上的酶切位置见表1。目的片段经2组双酶切均表现出相同的带型,电泳图谱见图1、2,iniB基因在51株对利福平不同表型结核分枝杆菌中未发现多态性。

表1 iniB基因酶切片段

2.2 iniB基因测序结果 大肠埃希菌阴性对照无扩增产物,50株结核分枝杆菌及BCG经PCR得到长度为1440 bp的iniB基因,与预期大小相符。随机抽取20个目的片段送上海英俊生物技术有限公司测序,包括依R菌9株,耐R菌6株,R敏感菌5株,测序结果18株与GeneBank公布的序列完全一致,1株R敏感菌在第703位发生碱基突变,由C突变为T,1株依R菌在第1 399位发生碱基突变,由G突变为A,氨基酸序列未发生突变。

3 讨论

日本Nakamura等[2]报道了1例依R菌感染病例。自1999年全国耐药结核病学术研讨会上国内首次提出结核分枝杆菌依赖利福平的现象[3]以来,国内各地依 R结核杆菌发生率为7.3～17.1%[4-9]。按我国目前有活动性肺结核患者450万计算[10],依R菌结核病患约有33～76万。临床依R菌肺结核患者具有病情重,耐多药,病程延长,化疗效果差和预后不良的临床特征[11-13],这是结核病防治领域一个新的问题。

对依R菌在有R和无R 2种生长条件下的研究中发现[14-18]：依R菌的形态、结构、染色性、毒力和蛋白质表达等方面均有明显差异。比较依R菌在有R和无 R两种生长条件下的蛋白图谱,发现84%的依R菌在含R管中结核分枝杆菌标准菌株H37Rv假设蛋白Rv0341表达量明显增加;86%的非依R菌和H37Rv标准株在含R管和无R对照管均没有Rv0341的高表达。提示：结核分枝杆菌假设蛋白Rv0341的高表达与依 R菌结核病密切相关[19]。

基于依R菌和非依R菌在蛋白Rv0341表达方面的差异,本试验针对Rv0341编码基因iniB进行了限制性片段长度多态性分析,发现其酶切后与结核标准菌株H37Rv、BCG的酶切图谱相同,在依R菌、耐R菌及R敏感结核杆菌中不具有多态性,是相对保守的基因,测序结果也证实了不同表型结核杆菌的iniB无突变。

综上分析提示：结核分枝杆菌在蛋白 Rv0341表达方面的差异可能是RNA转录差异或利福平诱导的结果。

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