黄芪对肝纤维化的防治作用

王登妮 ，徐军全 *，宋维芳 ，张晓阳 ，王明亮 ，梁永刚

（1.山西医科大学汾阳学院科技中心，山西汾阳 032200；2.天津医科大学第二医院病理科，天津 300211）

在抗肝纤维化的众多药物中，中药黄芪及其复方制剂是一类有很大发展潜力的药物。以往的动物实验结果显示，黄芪具有抑制肝组织胶原沉积和防治肝纤维化的作用，还可改善肝脏微循环，增强网状内皮系统的吞噬功能，促进肝再生。然而有关其抗肝纤维化的机制还有待进一步研究。内毒素可激活肝枯否细胞（Kupffer cell，KC）合成与释放细胞因子（cytokine）和炎症介质，并在肝纤维化的发生及发展中发挥作用，内毒素通过诱导TNF-α产生[1]，促进成纤维细胞和间质细胞增殖和分化，使细胞外基质（extracellular matrix，ECM）产生增多。本研究通过观察黄芪对慢性肝纤维化过程中血浆内毒素水平的影响及意义，进一步探讨黄芪防治肝纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物及材料

健康清洁级雌性 Wistar大鼠，体重（230±20）g，购自山西医科大学实验动物中心；四氯化碳（CCl4）为中国中邦化工分析纯；鲎试剂盒购自上海伊华医学科技公司，天狼猩红、固绿FCF、羟脯氨酸（HYP）标准品购自美国Sigma公司；黄芪注射液（成都地奥九鸿制药厂），丙二醛（MDA）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所第一分所），丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒（北京北化康泰临床试剂有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 分组 30只Wistar大鼠饲养1周后随机分为三组，A组（正常对照组）、B组（模型组6周）、C组（黄芪处理组6周）。

1.2.2 造模 A组不给予处理，其他两组给予首剂5 ml/kg体重皮下注射CCl4分析纯，然后按3 ml/kg体重皮下注射40%CCl4植物油（V/V）混合液，每周2次。C组于造模同时给予皮下注射黄芪注射液[800 mg/（kg·d）][2]。

1.2.3 取材 在无菌无热源条件下，从大鼠腹主动脉采血，注入加有肝素的无热源玻璃试管中，离心取血浆置于玻璃试管中封口，低温保存。取新鲜肝左叶一部分立即固定于4%多聚甲醛中，24 h内石蜡包埋；一部分于-80℃保存。

1.2.4 染色 行常规HE染色。

1.2.5 天狼猩红胶原染色 组织切片用天狼猩红染液室温孵育60 min，中性树胶封片，显微镜下进行观察。

1.2.6 肝组织HYP含量测定 取冻存肝组织约0.2 g消化，取肝脏消化液1.0 ml，对照管为1.0 ml去离子水，然后依次加入:①0.1 mol/L柠檬酸缓冲液（pH 6.0）0.5 ml和 0.05 mol/L氯胺T溶液1.0 ml，37℃水浴 25 min；②3.15 mol/L过氯酸溶液1.0 ml，室温下作用5 min；③10%对二甲氨基苯甲醛溶液1.0 ml，100℃沸水 5 min；④冰浴冷却，测定 560nm处吸光度。制备标准曲线，在HYP标准曲线上求得待测肝组织HYP含量。

1.2.7 产色基质偶氮法鲎试剂测定血浆内毒素 参照试剂盒说明书操作。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 一般情况及造模效果

实验过程中，正常对照组大鼠健康状况良好，肝脏表面光滑，颜色红润；模型组大鼠的活动及摄食减少，精神萎靡，体重下降，皮毛杂乱无光泽，肝脏表面不光滑，颜色灰暗，体积变大，边缘圆钝，肝组织 HYP含量和肝FI明显升高；黄芪处理组大鼠症状比模型组轻，体重下降比较慢，肝组织HYP含量和肝FI比模型组降低，结果见表1。

表1 各组大鼠血浆ET、ALT及肝组织MDA、Hyp、FI的变化（±s）

表1 各组大鼠血浆ET、ALT及肝组织MDA、Hyp、FI的变化（±s）

与正常对照组比较，aP<0.01；与模型组比较，bP<0.05

组别 n HYP（mg/g） FI（%） ET（Eu/ml） ALT（U/L） MDA（nmol/mg肝脏）正常对照组模型组黄芪处理组5780.30±0.030.77±0.06a 0.66±0.06ab 0.33±0.142.18±0.71a 1.24±0.40ab 0.08±0.010.55±0.07a 0.42±0.03ab 44.96±8.26156.36±13.17a 127.41±12.10ab 0.17±0.031.41±0.06a 1.08±0.07ab

2.2 HE染色

正常对照组肝组织结构清晰，肝细胞大小均匀，无变性、坏死，肝小叶结构存在，小叶内肝细胞索排列整齐；模型组肝细胞可见明显脂肪变性，汇管区纤维组织明显增生；黄芪处理组纤维组织增生不明显（图1）。

2.3 胶原染色

显微镜下重点观察红色胶原纤维分布情况。正常对照组仅于血管周围见少量红色纤维；模型组肝组织中红色纤维明显增多，由汇管区和中央静脉向肝小叶内伸展分隔，相互连接形成较粗大的纤维间隔；黄芪处理组见较细的红色纤维走行于血管周围，数量较正常对照组稍多（图2）。

2.4 黄芪对血浆内毒素、ALT和肝组织MDA变化的影响

黄芪处理组与模型组比较，血浆内毒素、ALT和肝组织MDA均明显降低，结果见表1。

3 讨论

研究显示，血浆内毒素水平在肝纤维化过程中逐渐升高，提示肠源性内毒素血症在肝纤维化发生及发展中起重要作用[3-4]。内毒素通过诱导TNF-α和IL-1[5]产生，促进成纤维细胞和间质细胞增殖和分化，使细胞外基质（extracellular matrix，ECM）产生增多。降低血浆内毒素水平可阻断上述途径，逆转肝纤维化。

目前，治疗肝纤维化是防治慢性肝病发展为肝硬化的重要手段，寻找有效抗肝纤维化的药物是研究热点，在抗肝纤维化的众多药物中，中药黄芪及其复方制剂是一类有很大发展潜力的药物。黄芪能够减少免疫损伤所致肝内胶原成分的异常沉积，对实验性肝纤维化有明显的治疗作用，且随着疗程的延长，其作用有所增强[6-7]。黄芪注射液的主要成分是黄芪总黄酮、黄芪总皂苷和黄芪多糖，具有益气养心、扶正祛邪的功效。张银娣等[8]研究了黄芪皂苷对实验性肝损伤的保护作用，证实黄芪可保护肝细胞膜，降低血清ALT、AST水平。MDA是一种脂质过氧化物，其组织中的含量可反映机体内脂质过氧化的程度[9]。肝纤维化的形成有多种细胞因素的参与，与氧自由基、脂质过氧化产物等密切相关[10]。有研究报道黄芪有抗脂质过氧化、抗氧自由基的作用[11]。张弢等[12]的研究提示复方黄芪颗粒可以在蛋白水平增强MMP-2酶蛋白的表达，同时抑制TIMP-2酶蛋白的表达，促进ECM的降解，从而达到逆转肝纤维化的目的。然而黄芪防治肝纤维化的作用机制尚不很清楚。

本实验对黄芪抗肝纤维化的机制进行了初步研究，笔者通过观察黄芪对肝纤维化过程中血浆内毒素水平的影响来探讨黄芪抗肝纤维化的作用机制。从肝组织病理学、HYP含量和肝FI方面证实黄芪可以防治CCl4所致的肝纤维化；黄芪在抑制大鼠肝纤维化过程中，可降低血浆内毒素水平，使肝纤维化程度减轻。本实验同时观察到黄芪在防治肝纤维化过程中可以降低血清ALT、肝组织MDA等水平，发挥抗肝纤维化作用。从本实验结果可推测黄芪的抗肝纤维化可能与其减缓肠源性内毒素血症有关。黄芪对内毒素的下游传导通路是否有影响有待进一步研究。

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