高效液相色谱法测定血清中敌敌畏的质量浓度*

鲍红荣

（浙江省临安市人民医院临床药学室，浙江 杭州 311300）

敌敌畏(dichlorvos)为四大有机磷农药之一，杀虫效果显著,被广泛应用于各类农作物。其毒性中等，大鼠急性经口半数致死量（LD50)为 56～80 mg/kg，急性经皮 LD50为 75～105 mg/kg。临床上，敌敌畏中毒很常见，目前多采用血液灌流的方法治疗其急性中毒[1]。敌敌畏的检测分析方法主要有薄层层析-容量法[2]、气相色谱法等[3-5]，但前者操作烦琐、分析周期长、工作强度大，后者不适于分析高沸点有机物、高分子和热稳定性差的化合物。目前已有应用高效液相色谱法检测蔬菜、水体中有机磷农药的报道[6-7]，但少有此法用于测定血清中敌敌畏质量浓度的报道。笔者就此进行了相关研究，现报道如下。

1 仪器与试药

Agilent 1100型Series高效液相色谱仪（附紫外检测器，色谱数据处理机）；HP-7550型电脑检测仪；Anke TGL-18G-C型高速离心机；SZ-1型快速混匀器；AL104型电子天平。敌敌畏标准品（迪马科技公司）；卡马西平标准品（中国药品生物制品检定所）；色谱纯乙腈、重纯化水均过0.45!m微孔滤膜。

表1 日内和日间精密度试验结果

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Zorbax SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5!m）；流动相：乙腈 -水（50 ∶50)；流速：1.0 mL/min；检测波长：211 nm；进样量：10!L；柱温：40 ℃ 。在此色谱条件下，内标峰与样品色谱峰能达到基线分离，卡马西平保留时间为4.43 min,敌敌畏保留时间为5.00 min。高效液相色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.2 溶液制备

精密称取敌敌畏标准品0.060 2 g，置50 mL量瓶中，加乙腈至刻度，摇匀即得质量浓度为1 200!g/mL的溶液，再将此溶液分别配制成 3，15，30，75，150，300，600!g/mL 的溶液，冰箱低温存放，即为敌敌畏标准溶液。精密称取卡马西平标准品0.010 2 g，置10 mL量瓶中，加乙腈至刻度，摇匀，即得质量浓度为1 g/L的溶液，再用移液管精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，加乙腈至刻度，得质量浓度为100!g/mL的卡马西平溶液，即内标溶液。精密称取80%的敌敌畏乳油0.020 2 g，置50 mL量瓶中，用乙腈溶解至刻度，配制成敌敌畏质量浓度为320!g/mL的溶液，即为供试品溶液。

2.3 方法学考察

线性关系考察：精密吸取空白血清100!L，置2 mL一次性尖底具塞离心试管中，分别加入各种质量浓度的敌敌畏标准溶液100!L与卡马西平内标溶液100!L，将试管放入快速混匀器混合15 s，以12 000 r/min高速离心10 min，精密吸取上清液10!L进样测定，平行操作6次，以平均峰面积比值对质量浓度拟合，得回归方程为Ai/As=0.022 5+0.003 8C，r=0.999 8(n=6)。结果表明，敌敌畏质量浓度线性范围是3～600!g/mL，最低检测浓度为0.5!g/mL。

稳定性试验：精密吸取供试品溶液10!L，分别于室温下0，1，2，4，24 h时进样，在所选色谱条件下测定。结果峰面积的 RSD为1.18%（n=5），表明在24 h内溶液稳定性良好。

精密度试验：吸取敌敌畏标准溶液10!L，连续进样5次,在上述色谱条件下测定峰面积。再按日间精密度同法操作，连续进行6 d。结果见表1。

重复性试验：精密吸取供试品溶液5份，按线性关系考察项下操作制备血清样品，精密吸取10!L进样，测定峰面积，计算含量。结果的 RSD为2.16%（n=5）,表明方法重复性良好。

回收率试验：精密吸取低、中、高3种质量浓度的敌敌畏标准溶液各100!L，每种质量浓度各6份，按线性关系考察项下操作，结果见表2。

3 讨论

为保证各样品之间以及样品与标准曲线制备时的条件完全一致，各项操作一定要尽量平行一致，以减少误差。高效液相色谱法进样量小，很难控制每次进样量都完全相等，且其他一些原因如操作熟练程度、溶剂挥发性也会影响到色谱响应值，而应用内标定量法可消除这些因素引起的误差，还可简化操作，使操作易于掌握。因此，选择内标法为敌敌畏测定的定量方法。

选择一个合适的内标，对于测定结果的准确性、精密度具有重要意义。因此，要求内标物必须是样品中不含有的组分，即不应是患者可能同时服用的其他药物；内标物保留时间应与待测组分接近，但能完全分开，即分离度 R≥1.5；内标物有足够的纯度。卡马西平既不是体内内源性成分，也不是药物在体内可能产生的代谢物,且在210 nm波长处有较大的吸收[8]，与敌敌畏峰的分离度 R不低于1.5，基本符合敌敌畏测定时内标物的要求。

孙志伟等[9]对敌敌畏在190～300 nm波长范围内紫外扫描，发现敌敌畏在211 nm波长处有最大吸收，且杂质在此波长处吸收很小，而卡马西平也有较好吸收。笔者实际测定后也发现在此波长处两种物质均有较好出峰且分离度较好，故选定211 nm为检测波长。

多篇文献均选择流动相为甲醇-水体系，于是在Zorbax SBC18柱上，以甲醇-水体系作流动相，按不同比例进行了恒流洗脱试验，测定后发现杂质峰较多，且峰的分离度不好。因供试品溶液配制时溶剂为乙腈，故将流动相改为1∶1的乙腈-水[10]，测定后发现柱效最高，敌敌畏与卡马西平的峰形与分离度都较好，最终确定流动相为乙腈-水（50∶50）。

表2 回收率试验结果（n=6）

[1]Iwaki Y,Ohtani M.Poison elimination methods in acute poisonin[J].Nippon Geka Gakkai Zasshi,2000,101(11):787.

[2]闫慧芳，潘亚娟，王 健，等.血清中乐果、甲基对硫磷、甲胺磷和敌敌畏的快速高效薄层定性分析[J].中华劳动卫生职业病杂志,2006，26(7):437-438.

[3]陈 皑,周 瑛,王萍亚,等.气相色谱法测定蔬菜和水果中的有机磷残留农药[J].浙江工业大学学报,2004,32(5):585-588.

[4]李云飞,彭云霞,张承聪.气相色谱-质谱联用仪测定果蔬中12种农药残留量[J].云南大学学报（自然科学版）,2004,26（S0）:176-180.

[5]Salvador M,Frenich AG,Gonzalez FJE,et al.Determination of organophosphorus pesticides in vegetables by GC with pulsed flame-photometric detection,and confirmation by MS[J].Chromatographia,2006,64(11-12):667-672.

[6]郇宜俊,高广生，蒋锦良，等.HPLC法测定中毒病人体液中甲基对硫磷浓度[J].山东医药工业,1996,15(3):13-14.

[7]陈 浩,柳训才,李胜清,等.蔬菜中高毒有机磷农药多残留的检测方法研究[J].食品科学,2005,26(3):204-208.

[8]陈桂平,丁晓燕.紫外分光光度法检测卡马西平的血药浓度[J].中国航天医药杂志,2002,4(3):66.

[9]孙志伟,黄 颖,韩 枫.敌敌畏的高效液相色谱分析方法[J].中国石油和化工标准与质量，2007,27(7):19-21.

[10]何红东,吴玉琴.乙酰甲胺磷原药高效液相色谱分析[J].浙江化工,1998,29(2):39-40.