鱼精蛋白凝聚法测定和厚朴酚脂质体的包封率

刘卫斌，薛彦宁，秦永刚（.陕西榆林市第二医院，榆林市 79000；.陕西中药研究所，咸阳市 7000）

鱼精蛋白凝聚法测定和厚朴酚脂质体的包封率

刘卫斌1＊，薛彦宁1，秦永刚2（1.陕西榆林市第二医院，榆林市 719000；2.陕西中药研究所，咸阳市 712000）

目的：建立和厚朴酚脂质体包封率（EE）的测定方法。方法：以反相高效液相色谱法为分析手段，采用鱼精蛋白凝聚法测定和厚朴酚脂质体EE。结果：和厚朴酚检测浓度在2.006～160.512 mg·L-1范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系（r＝0.999 9），最低检测限和最低定量限分别为1.4、4.0 ng；鱼精蛋白凝聚法的平均回收率为（95.70±2.07）%，RSD＝1.71%（n＝9）；平均EE为85.87%。结论：鱼精蛋白凝聚法操作简单、可行、重现性好，适用于脂溶性药物和厚朴酚脂质体EE的测定。

和厚朴酚脂质体；反相高效液相色谱法；包封率；鱼精蛋白凝聚法

和厚朴酚为木兰科落叶乔木植物厚朴Magnolia officinalisCortex的有效成分，是从厚朴中分离得到的具有生物活性的小分子物质。药理学研究证明，和厚朴酚具有抗氧化[1]、抗焦虑[2]、抗菌[3]、抗血栓形成[4]和抗肿瘤[5～7]的作用。和厚朴酚水溶性差，几乎不溶于注射用水，故影响了其在临床中的应用。将和厚朴酚开发成脂质体剂型，可以解决其难溶问题，提高药物稳定性、载药量、靶向性及疗效。脂质体还可能延长和厚朴酚在体内的循环时间，改善其在体内的吸收及分布。脂质体制备过程中，包封率（EE）是控制质量与筛选处方和工艺条件的重要指标之一。2005年版《中国药典》（二部）规定，脂质体EE不得低于80%[8]，所以建立快速、准确的EE测定方法是研制脂质体重要的环节。本研究将以高效液相色谱（HPLC）法为分析手段，采用鱼精蛋白凝聚法测定建立一种简单、准确、可操作性强的测定和厚朴酚脂质体EE的方法。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC2010型HPLC系统（日本岛津公司）；AL104型电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。

1.2 试药

和厚朴酚对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110730-200408，纯度≥99.0%）；和厚朴酚原料药（西安融升生物科技有限公司，纯度≥98.0%）；磷脂（成都科龙化工试剂厂，纯度≥98.0%）；胆固醇（成都科龙化工试剂厂，纯度≥98.0%）；聚乙二醇（PEG，成都科龙化工试剂厂，分子量：2 000）；鱼精蛋白（美国Sigma公司，批号：YY15284）；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Phenomenex C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（65∶35）；柱温：25 ℃；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：294 nm；进样量：10 μL。理论板数按和厚朴酚色谱峰计算应不低于3 000。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.空白脂质体；B.和厚朴酚脂质体；C.和厚朴酚对照品Fig 1 HPLC chromatogramsA.blank liposomes；B.honokiol liposomes；C.honokiol control

2.2 对照品溶液的制备

精密称取和厚朴酚对照品50.16 mg，置于50 mL棕色容量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，配成含和厚朴酚浓度为1.003 2 mg·mL-1的对照品溶液，冰箱4℃贮存，备用。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密吸取一定体积的和厚朴酚对照品溶液，用流动相稀释成2.006 4、5.016、10.032、20.064、40.128、80.256、160.512 mg·L-1的溶液，按“2.1”项下色谱条件分别进样。以峰面积积分值（A）为纵坐标，和厚朴酚检测浓度（C，mg·mL-1）为横坐标，制备标准曲线，得回归方程为A＝16 400C－2 763（r＝0.999 9）。结果表明，和厚朴酚的检测浓度在2.006～160.512 mg·L-1范围内与峰面积积分值呈良好线性关系。

2.3.2 精密度试验 取5.016、20.064、80.256 mg·L-1的和厚朴酚对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件于日内（0、2、4、6、8、10 h）各时间点进样分析，测定峰面积积分值，计算日内精密度。结果，3个浓度的RSD分别为0.29%、0.21%、0.15%（n均为6），表明日内精密度良好。取相同浓度的和厚朴酚对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件于日间（1、2、3、4、5 d）进样分析，测定峰面积积分值，计算日间精密度。结果，3个浓度的RSD分别为1.92%、0.74%、1.59%（n均为6），表明日间精密度良好。

2.3.3 加样回收率试验 取空白脂质体溶液0.05 mL，置于2 mL EP离心管中，再分别加入7.5、30.0、120.0 μL浓度为1.003 2 mg·mL-1的和厚朴酚对照品溶液，加乙腈分别至1.5 mL，使和厚朴酚检测浓度分别为5.016、20.064、80.256 mg·L-1，超声1 min，12 000 r·min-1离心5 min，取上清液按“2.1”项下色谱条件进样分析，每个浓度平行操作3份，计算加样回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 1Results of recovery test（n＝9）

2.3.4 最低检测限和最低定量限测定 按“2.1”项下色谱条件，将2.0、1.0、0.5、0.1 mg·L-1的和厚朴酚对照品溶液分别进样10 μL，记录色谱图。采用基线信号与噪声比方法，以信号∶噪声＝3∶1时的浓度为最低检测限浓度；照《药品质量标准分析方法验证指导原则》[8]，以信号∶噪声＝10∶1时的浓度为最低定量限浓度。即最低检测限和最低定量限分别为1.4、4.0 ng。

2.4 和厚朴酚脂质体的制备

采用薄膜超声法，精密称取磷脂-胆固醇-PEG（1∶0.3∶0.08，W/W）/W为总脂，将和厚朴酚-总脂（1∶4）加入到一定量装有甲醇的圆底烧瓶中溶解，减压蒸发成薄膜，加入一定量水进行水化处理，超声处理，即得和厚朴酚脂质体。

2.5 粒径和电位测定

取和厚朴酚脂质体溶液，用超纯水稀释，测定其粒径大小和Zeta电位。结果，平均粒径为93.84 nm，平均电位为－21.8 mV。

2.6 鱼精蛋白凝聚法

采用鱼精蛋白凝聚法分离游离药物与脂质体。用移液枪精密吸取0.1 mL和厚朴酚脂质体于2 mL EP管中，加入10 mg·mL-1的鱼精蛋白溶液0.1 mL，涡旋60 s，静置3 min，加入1 mL生理盐水，混匀，室温下以3 000 r·min-1离心30 min，沉淀脂质体。精密吸取上清液0.1 mL，以流动相稀释后按“2.1”项下色谱条件测定，并计算游离药物含量（C游）。

2.7 鱼精蛋白凝聚法加样回收率试验

配制低、中、高浓度（0.106 1、0.285 6、0.641 5 mg·L-1）的游离和厚朴酚乙醇-水溶液，加入空白脂质体（粒径约为100 nm），得混合脂质体混悬液。取上述脂质体混悬液0.1 mL，添加0.1 mL 鱼精蛋白（10 mg·mL-1），搅匀，静置3 min，加入1.0 mL生理盐水，3 000 r·min-1离心30 min，沉淀脂质体。精密吸取上清液0.1 mL，以流动相稀释后按“2.1”项下色谱条件测定，并计算加样回收率，结果见表2。

表2 鱼精蛋白凝聚法加样回收率试验结果（n＝9）Tab 2 Results of recovery test of protamine aggregation method（n＝9）

2.8 和厚朴酚脂质体EE测定

按“2.1”项下色谱条件，测定“2.4”项下制得的和厚朴酚脂质体中和厚朴酚含量（C总），并根据下式计算和厚朴酚脂质体EE：EE＝（C总－C游）/C总×100%。结果，和厚朴酚在脂质体中的EE可达到80%以上，平均值为85.87%，详见表2。

表3 和厚朴酚脂质体EE测定结果Tab 3 Encapsulation efficiency of honokiol liposomes

3 讨论

为准确测定脂质体EE，将脂质体和游离药物分离是关键步骤。本试验曾采用SephadexG-50凝胶柱层析法分离脂质体与游离和厚朴酚，因为和厚朴酚不溶于水，当用pH 7.4的PBS进行洗脱时，游离和厚朴酚截留在凝胶柱顶端，待脂质体完全洗出柱子后，截留在柱子顶端的游离和厚朴酚缓慢被洗出凝胶柱，色谱峰很宽且不规则，洗脱时间很长，测定不准确。本试验也曾采用透析法，此法虽操作简单，但耗时较长，且重复性不好，故该方法有待考察。超速离心法对离心机转速要求较高，仪器耗费较大，离心时间通常需要1 h以上，方法成本较高。和厚朴酚水溶性差，而凝胶柱分离法、透析法、超滤法等都是用于分离水溶性药物。为了探讨一种简单、速效、准确的脂质体EE的测定方法，本试验建立了鱼精蛋白絮凝-离心法分离脂质体，以RP-HPLC法为分析手段，测定脂质体药物EE。

鱼精蛋白的最大特点就是碱性氨基酸占有较大比例[9]，其等电点为10～12，可溶于水和稀酸，热稳定性较好。本文所用鱼精蛋白是鲑鱼精蛋白（salmine），约含2/3以上的精氨酸。精氨酸是一种含有胍基的碱性氨基酸，带正电，正是由于这些带有正电荷的胍基的大量存在，多聚阳离子鱼精蛋白会与带负电或中性的脂质体产生絮凝作用，常规离心即可将脂质体和游离药物分离。因此，它是一种针对脂质体电荷性质的凝聚离心法，具有快速、可操作性强的优点。鱼精蛋白凝聚法的适用范围比较广泛，可以测定不同溶解性质药物脂质体的EE，但此法也存在一定的局限性：脂质体的Zeta电位对鱼精蛋白凝聚法测定脂质体EE有一定影响，它更适于中性或负电荷脂质体的分离。

[1]Ogata M，Hoshi M，Shimotohno K.Antioxidant activity of magnolol，honokiol，and related phenolic compounds[J].J Am OilChem Soc，1997，74（5）：557.

[2]Kuribara H，Kishi E，Hattori N.Application of the elevated plus-maze test in mice for evaluation of the content of honokiol in water extracts of magnolia[J].Phytother Res，1999，13（7）：593.

[3]Syu WJ，Shen CC，Lu JJ，et al.Antimicrobial and cytotoxic activities of neolignans from Magnolia officinalis[J].Chem Biodivers，2004，1（3）：530.

[4]Pyo MK，Lee Y，Yun-Choi HS.Anti-platelet effect of the constituents isolated from the barks and fruits of Magnolia obovata[J].Arch Pharm Res，2002，25（3）：325.

[5]Yang SE，Hsieh MT，Tsai TH，et al.Downmodulation of Bcl-XL，release of cytochrome c and sequential activation of caspases during honokiol-induced apoptosis in human squamous lung cancer CH27 cells[J].Biochem Pharmacol，2002，63（9）：1 641.

[6]Wang T，Chen F，Chen Z，et al.Honokiol induces apoptosis through p53-independent pathway in human colorectal cell line RKO[J].World J Gastroenterol，2004，10（15）：2 205.

[7]Hirano T，Gotoh M，Oka K.Natural flavonoids and lignans are potent cytostatic agents against human leukemic HL-60 cells[J].Life Sci，1994，55（13）：1 061.

[8]Bai X，Cerimele F，Ushio-Fukai M，et al.Honokiol，a small molecular weight natural product，inhibits angiogenesis in vitro and tumor growth in vivo[J].J Biol Chem，2003，278（37）：35 501.

[9]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（二部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：附录181、附录172.

[10]Sun P，Wang ZH ，Zheng MX.The research of protamine and application in food industry[J].Food Res Develop，2003，4（2）：15.

Determination of Encapsulation Efficiency of Honokiol Lipsomes by Protamine Aggregation Method

LIU Wei-bin，XUE Yan-ning（Yulin Municipal Second Hospital of Shaanxi Province，Yulin 719000，China）
QIN Yong-gang（Shaanxi Institute of Chinese Materia Medica，Xianyang 712000，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the determination of encapsulation efficiency（EE）of honokiol liposomes.METHODS：RP-HPLC method was adopted for the analysis of honokiol liposomes.Protamine aggregation method was applied to determinate the encapsulation efficiency of honokiol liposomes.RESULTS：The linear range of honokiol was 2.006～160.512 mg·L-1.The limits of detection and quantitation were 1.4 ng and 4.0 ng，respectively.The mean recovery rate of protamine aggregation method was（95.70±2.07）%（RSD＝1.71%，n＝9）.The mean encapsulation efficiency of honokiol liposomes was 85.87%.CONCLUSION：The protamine aggregation method is simple，practical and reproducible for determination of the encapsulation efficiency of honokiol liposomes.

Honokiol liposomes；RP-HPLC；Encapsulation efficiency；Protamine aggregation method

R283.2；283.69

A

1001-0408（2010）39-3695-03

＊主任药师。研究方向：中药学。电话：0912-3362085。E-mail：leibaolin@163.com

2010-06-16

2010-08-27）