RP-HPLC法测定射干合剂中黄酮类多指标成分的含量Δ

唐跃年，金，张 健，陆晓彤（上海交通大学医学院附属新华医院药剂科，上海市 200092）

RP-HPLC法测定射干合剂中黄酮类多指标成分的含量Δ

唐跃年＊，金，张 健，陆晓彤（上海交通大学医学院附属新华医院药剂科，上海市 200092）

目的：建立以反相高效液相色谱法同时测定射干合剂中黄芩苷等5种黄酮类化合物含量的方法。方法：样品经超声提取后，用Inertsil®ODS-3色谱柱分离样品，流动相为乙腈-1‰磷酸（pH 2.25，梯度洗脱），流速为1 mL·min-1，柱温为室温，检测波长为260 nm；外标法定量。结果：黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、射干苷、次野鸢尾黄素的线性范围均为0.05～50 μg·mL-1（r均≥0.998 9）；平均加样回收率为96.52%～101.22%，RSD均≤4.4%（n＝9）。结论：本方法简便、准确、灵敏度高，可用于射干合剂中黄酮类化合物多指标成分的含量测定，也可用于其制剂及体内指标成分的研究。

黄酮类化合物；反相高效液相色谱法；射干合剂；含量测定

射干合剂为本院自制制剂，具有宣肺清热、止咳祛痰平喘的作用，用于治疗感冒咳嗽、急性支气管炎及哮喘性支气管炎、多痰，有很高的临床疗效。中药复方制剂的质量控制，目前常采用指纹图谱[1～4]、多指标含量测定[5]方法。研究发现[6～8]射干中黄酮类化合物具有广泛的药理活性，如抗炎、降压、清除自由基、抗心律失常等作用，在临床上应用广泛。为了提高本制剂的质量，控制本制剂临床疗效的稳定性，笔者对射干合剂中黄酮类化合物多指标化学成分进行了相关分析。

1 仪器与材料

1.1 仪器

1100系列高效液相色谱（HPLC）仪（美国惠普公司）；Labofuge 400R型高速离心机（上海力新有限公司）；XW-80型旋涡混合器、XW-80A型液体快速混合器（上海医科大学仪器厂）；BX 50型光学显微镜（日本Olympus公司）；pHS-3TC型精密数显酸度计（上海天达仪器有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）；As3120B型超声波清洗器（上海医用分析仪器厂）。

1.2 试药

黄芩苷（baicalin，BCL，批号：110715-200815）、黄芩素（baicalein，BCN，批号：111595-200604）、汉黄芩素（wogonin，WGN，批号：111514-200403）、射干苷（tectoridin，TRD，批号：110715-200815）、次野鸢尾黄素（irisflorenti，IRT，批号：110715-200815）对照品均购自中国药品生物制品检定所；射干合剂（上海美优制药厂加工，批号：070601、071201、081001）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国Tedia公司）；水为双蒸水，其余试剂均为分析纯；全部溶剂均采用0.22 μm微孔滤膜过滤。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Inertsil®ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-1‰磷酸（pH 2.25），梯度洗脱（0→30→60→70 min：乙腈的体积百分数为10%→30%→60%→10%）；流速：1 mL·min-1；进样量：20 μL；紫外检测波长：260 nm；柱温：室温。色谱见图1。

图1 高效液相色谱图A.混合对照品；B.供试品；C.阴性对照；1.黄芩苷；2.黄芩素；3.汉黄芩素；4.射干苷；5.次野鸢尾黄素Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed substance；B.test samples；C.negative control；1.baic-alin；2.baicalein；3.wogonin；4.tectoridin；5.irisflorentin

2.2 对照品溶液的制备

分别称取BCL、BCN、WGN、TRD、IRT各适量，以甲醇制备成1 mg·mL-1的对照品贮备液，贮藏于－20℃，备用。混合对照品溶液系列由上述各贮备液加入甲醇稀释而成，稀释浓度分别为1 000、1 000、1 000、2 000、2 000 ng·mL-1。

2.3 供试品溶液的制备

精密吸取1 mL射干合剂至25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，超声20 min，10 000 r·min-1离心6 min，吸取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤后备用。

2.4 制备方法对样品测定的影响

2.4.1 提取方法的比较 （1）有机溶剂提取法：精密吸取本品20 mL，加稀盐酸调节pH至2，用醋酸乙酯振摇提取2次，每次30 mL，合并醋酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇20 mL使溶解，摇匀，再精密吸取1 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜过滤后作为供试品溶液。（2）超声法：按“2.3”项下方法操作。

取2种方法制备的供试品溶液各20 μL进样，用色谱峰面积比较各黄酮类化合物的提取率。结果，除IRT、WGN 2种化合物的提取率无明显区别外，TRD的提取率超声法比有机溶剂提取法提高了25%，BCL、BCN更是提高了1倍以上，可见超声法明显优于有机溶剂提取法。2种提取方法比较结果见表1。

表1 2种提取方法比较结果（n＝3）Tab 1 Comparison of 2 kinds of extraction processes of flavonoids（n＝3）

2.4.2 超声时间对黄酮类化合物的影响 为了考察超声时间对样品中黄酮类化合物测定的影响，取射干合剂（批号：071201）1 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，分6份，分别在超声0、1、5、10、20、30 min后取出样品。结果表明，5种黄酮类化合物在20 min后基本趋于提取完全，所以本试验采用超声提取20 min。超声时间对黄酮类化合物提取率的影响见图2。

图2 超声时间对黄酮类化合物提取率的影响Fig 2 Effect of ultrasonic time on yield of flavonoids

2.5 线性关系考察

分别精密吸取上述混合对照品溶液0.012 5、0.125 0、1.250 0、6.250 0、12.500 0 mL，分别置25 mL容量瓶中，加入甲醇稀释到刻度，摇匀，制成系列浓度为0.05～50 μg·mL-1的混合对照品溶液。各取20 μL进样，以色谱峰峰面积积分值（Y）为纵坐标，对照品溶液浓度（C，μg·mL-1）为横坐标，制备标准曲线，得其回归方程分别为：

结果表明，上述5种化合物均在0.05～50 μg·mL-1浓度范围内与各自峰面积积分值呈良好线性关系。

2.6 方法的回收率和重现性试验

精密吸取射干合剂1 mL，精密加入BCL、BCN、WGN、TRD、IRT混合对照品溶液，每种化合物设计3个不同浓度，每个浓度制备3份供试品溶液进行测定，用9个测定结果评价方法的回收率，结果见表2。另外，对3个水平添加了混合对照品溶液的阴性样品按同法检测分析，连续5 d进行重现性试验，结果BCL、BCN、WGN、TRD、IRT的日间RSD分别为4.7%、3.2%、3.9%、4.6% 、5.3%。

表2 加样回收率试验结果（n＝9）Tab 2Results of recovery test（n＝9）

2.7 稳定性试验

取射干合剂供试品溶液，置室温24 h，每隔4 h进样，测定峰面积。结果，BCL、BCN、WGN、TRD、IRT的RSD分别为2.1%、1.8%、2.5%、1.6%、3.1%，表明供试品溶液至少在24 h内稳定。

2.8 专属性试验

取无射干、黄芩的阴性样品，按“2.3”项下方法制备阴性对照溶液，按上述方法测定。结果发现，阴性对照不干扰BCL、BCN、WGN、TRD、IRT的测定，表明方法专属性好。

3 讨论

3.1 提取及测定方法的选择

考虑到中药成分的复杂性和不可预知性，应尽可能地保留射干合剂样品中更多色谱信息。本试验中的样品处理不采用常见的溶剂提取等方法，而采用超声提取法，能保留制剂中更多成分，避免了溶剂提取中药中有效成分的损失[9]。

目前，对单一化合物的含量测定已有不少报道，对多组分的同时测定报道较少；文献[10]认为黄芩苷为黄芩素的7-O-葡糖醛酸结合物，黄芩苷类似于其它黄酮类化合物，存在吸收差的问题，并认为可在人体肠道通过肠菌群水解为黄芩素后才被人体吸收。复方中药制剂的多组分测定不仅是中药质量控制的重要方法[5]，也为中药制剂的指标成分与临床疗效间的相关性研究提供了一种科学方法。

3.2 色谱条件的优选

由于IRT在本品中含量最低，所以在选择检测波长时尽可能优先考虑其测定时的最大吸收。本试验用HPLC法能分离射干合剂中常见的黄酮类化合物TRD、BCL、BCN、IRT、WGN，故综合上述各化合物的紫外吸收特点，选择260 nm作为紫外检测波长。选择流动相时，开始用甲醇、醋酸作流动相，发现各化合物的峰形较宽，后改用乙腈、磷酸作流动相，各化合物的峰形变窄；磷酸选择1‰浓度，主要是因为pH＜2容易使色谱柱损伤，而pH＞3则化合物峰形变宽；采用该流动相梯度洗脱，所测定5种黄酮类化合物分离度好，保留时间分别为23.32、30.08、44.18、50.57、53.12 min。

综上，本方法简便、准确、灵敏度高，可用于射干合剂中黄酮类化合物多指标成分的含量测定，也可用于其制剂及体内指标成分的研究。

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Content Determination of Multiple Indicator Constituents of Flavonoids inBelamcanda chinensisMixture by RP-HPLC

TANG Yue-nian，JIN Liang，ZHANG Jian，LU Xiao-tong（Dept.of Pharmacy，Xinhua Hospital of Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200092，China）

OBJECTIVE：To establish RP-HPLC method for the content determination of 5 kinds of multiple indicator constituents of flavonoids inBelamcanda chinensismixture such as baicalin.METHODS：Samples were extracted with selective ultrasound extraction.The separation was performed on Inertsil®ODS-3 column with mobile phase consisted of acetonitrile-1‰ phosphoric acid（pH＝2.25，gradient elution）at flow rate of 1 mL·min-1.The column temperature was room temperature and detection wavelength was set at 260 nm.The method was qualified by an external standard mode.RESULTS：The linear ranges of baicalin，baicalein，wogonin，tectoridin and irisflorentin were all 0.05～50 μg·mL-1（r≥0.998 9）with average recoveries of 96.52%～101.22%（RSD≤4.4%，n＝9）.CONCLUSION：This method is simple，convenient，accurate and sensitive for content determination of multiple indicator constituents of flavonoids inB.chinensismixture and constituent study of preparation and internal index constituent.

Flavonoids；RP-HPLC；Belamcanda chinensismixture；Content determination

R283.665；R927.2

A

1001-0408（2010）39-3714-03

2009-11-08

2010-03-08）