盐酸二甲双胍在小鼠体内的药动学和组织分布

李发胜，池晓峰，刘海日，赵辉，孙文平，刘茜#（.大连医科大学化学教研室，大连市6044；.沈阳药科大学，沈阳市 006）

盐酸二甲双胍（Metformin hydrochloride，MH）是临床上常用的治疗非胰岛素依赖型和部分胰岛素依赖型糖尿病的药物，它主要抑制肠壁吸收葡萄糖，增加骨骼肌和周围组织对葡萄糖的摄取和利用，增加肝细胞对葡萄糖的摄取、抑制高血糖素的释放或抑制胰岛素拮抗物的作用[1]。此外，该药在肥胖症[2]、非酒精性脂肪肝[3]、代谢综合征[4]、多囊卵巢综合征[5]等方面也有临床应用，但对于这些作用的分子机制并不完全了解。目前对于盐酸二甲双胍的研究大多为有关人体的药动学研究[6]，而对于组织分布的研究较少。本实验旨在了解盐酸二甲双胍在小鼠体内的药动学和组织分布情况，为临床合理用药和进一步研究其新应用的作用机制提供依据。

1 材料

1.1 仪器

Agilent1200系列高效液相色谱（HPLC）仪，包括泵系统、二极管阵列检测器及工作站等。

1.2 试药

盐酸二甲双胍片（上海施贵宝制药有限公司，批号：0801055，规格：每片500 mg）；盐酸二甲双胍及内标阿替洛尔标准品（中国药品生物制品检定所，批号分别为、100664-200602、100117-200504，纯度均为100%）；乙腈、甲醇为色谱纯；其余试剂为分析纯；水为超纯水。

1.3 动物

健康昆明系♂小鼠90只，体质量18～22 g，由大连医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK（辽）2008-0002。

2 方法与结果

2.1 给药方案与样品采集

所有小鼠均在实验前禁食12 h，自由饮水。30只小鼠随机分为10个时间组，每组3只。精密称取盐酸二甲双胍片溶于生理盐水，配制成8 mg·mL－1溶液，单次灌胃给药200 mg·kg－1。于给药前0 h和给药后0.33、0.67、1、2、3、4、6、8、10 h各时间点经眼球后静脉丛取血，每个时间点约采集200 μL，置于肝素化的EP管中。离心（5 000 r·min－1）5 min，取血浆100 μL置于－20℃下保存。小鼠采血后，立即处死，在上述各时间点，迅速取出心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、肌肉置于生理盐水中，用生理盐水将样品洗净，用滤纸吸干组织表面水份后，分别称量各脏器湿重，加4倍生理盐水匀浆，制成组织匀浆液，－20℃冷冻保存。

2.2 色谱条件及方法专属性考察

色谱柱：Diamonsil C18（200 mm×4.6 mm，5µm）；流动相：10 mmol·L－1NaH2PO4/10 mmol·L－1十二烷基硫酸钠（pH 3.5）-甲醇（47∶53）；流速：1.0 mL·min－1。检测波长：235 nm。

取空白血浆、空白血浆+盐酸二甲双胍和内标标准品、血浆样品（服药后0.67 h）、空白小肠组织、空白小肠组织+盐酸二甲双胍和内标标准品及小肠组织样品（服药后0.67 h）进样测定，色谱见图1。

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatography

由图1可见，二甲双胍保留时间约为15.8 min，内标保留时间约为13.7 min，血浆和组织中二甲双胍与内标、内源性物质分离良好且完全。

2.3 标准溶液制备

精密称取盐酸二甲双胍标准品20 mg，置于100 mL容量瓶中，加超纯水至刻度，摇匀，即得200 mg·L－1的标准贮备液。精密称取内标标准品5 mg，置于100 mL容量瓶中，加超纯水至刻度，摇匀，即得50 mg·L－1的标准贮备液。

2.4 样品处理

取样品100 μL置于离心管中，加入乙腈200 μL、内标30 μL，涡旋混合10 min，离心（10 000 r·min－1）10 min，取上清液20µL进样。

2.5 标准曲线和定量限

以“2.1”项下给药前0 h采集的血浆和组织为空白样品，分别取空白血浆和组织匀浆液100µL，各加盐酸二甲双胍和内标标准系列溶液，制备成相当于盐酸二甲双胍血浆浓度为2、4、8、15、30、60、100 mg·L－1和组织浓度为5、8、15、30、60、100、120 mg·L－1的模拟生物样品，按“2.4”项下方法操作。以盐酸二甲双胍浓度（X）为横坐标，盐酸二甲双胍与内标峰面积比值（Y）为纵坐标，用加权（W＝1/X2）最小二乘法进行回归运算，求其线性回归方程。血浆和各组织样品的线性回归方程见表1。

表1 小鼠血浆及各组织中线性回归方程Tab 1 Equations of linear regression in plasma and tissues of mice

经计算得血浆中定量检查下限为2 mg·L－1，组织匀浆液中定量检查下限为5 mg·L－1。

2.6 回收率、精密度和稳定性

按规定方法考察了盐酸二甲双胍在低、中、高浓度（5、15、80 mg·L－1）的血浆和小肠组织方法回收率和日内、日间RSD；另考察了含盐酸二甲双胍浓度为5、15、80 mg·L－1的血浆或组织样品在室温放置24 h、反复冻融2次及冰冻20 d条件下的稳定性。结果显示，血浆或组织样品室温放置24 h，RSD在0.5%～6.8%之间；反复冻融2次，RSD在2.1%～11.3%之间；冰冻20 d，RSD在1.2%～8.2%之间，说明样品稳定性良好。回收率与精密度结果见表2。

表2 回收率与精密度结果（n＝5）Tab 2Recovery and precision test（n＝5）

由表2可见，该结果符合生物样品分析要求。

2.7 药动学研究

按“2.4”项下操作，进样分析小鼠血浆及组织样品，计算各时间点样品中的二甲双胍浓度，平均浓度-时间曲线见图2。

采用DAS 2.0软件对数据进行拟合处理，二甲双胍在小鼠体内的经时过程符合口服给药二室模型。主要药动学参数AUC为（52.93±2.34）mg·h·L－1，CL为（0.059±0.002）L·h－1，消除相t1/2为（3.61±0.22）h，tmax为0.67 h，Cmax为（18.61±0.78）mg·L－1。

2.8 组织分布

图2 血浆及各组织中盐酸二甲双胍的浓度-时间曲线Fig 2 Plasma concentration-time curves of metformin hydrochloride in plasma and tissue

小鼠灌胃给药后，其组织浓度分布见图2。在给药0.67 h后，所有组织中均能测到二甲双胍；给药10 h后，心、肝、脾、肺中检测不到二甲双胍。小肠、肺、肝、肌肉、脾、肾、胃、心脏各组织中AUC分别为（952.76±66.53）、（157.38±11.11）、（282.77±5.49）、（236.35±8.64）、（101.734±0.85）、（308.773±4.94）、（294.601±6.38）、（137.542±1.83）mg·h·L－1。

3 讨论

本实验建立了分析盐酸二甲双胍在小鼠体内药动学和组织分布的方法。在浓度测定时，选用乙腈为蛋白沉淀剂处理样品，方法较为简单；选用十二烷基硫酸钠离子对试剂，可使二甲双胍保留时间优化；选择内标阿替洛尔，峰形良好，理论塔板数高且与盐酸二甲双胍及血浆中其它内源性物质互不干扰，得到了较好的分离效果。因此，该方法简单、快速、准确。

小鼠药动学研究结果表明，二甲双胍进入体内后吸收迅速，血中药物浓度tmax约为0.67 h，随后血药浓度下降迅速。二甲双胍在体内滞留时间较短，清除速率较快。

组织分布结果表明，给药后二甲双胍迅速分布，药物主要蓄积在小肠、胃、肝、肾中，在小肠中高浓度蓄积，肾、胃和肝中也较多，肺、心及脾中较少。给药10 h后心、肝、脾、肺中已检测不到二甲双胍，在体内清除也快，这与药动学结果相符合。

二甲双胍在小肠中的含量远高于其它组织，说明在服药后一段时间内胃肠道壁内会聚集较高水平的二甲双胍，口服盐酸二甲双胍后主要在小肠吸收；在肝中二甲双胍含量也较高，说明肝也是二甲双胍作用的主要器官；在肾中的二甲双胍含量也处于较高水平，说明肾为二甲双胍排泄的主要器官，与文献报道[7]相吻合。

[1]李 端.药理学[M].第6版.北京：人民卫生出版社，2003：358.

[2]Dastjerdi MS，Kazemi F，Najafian A，et al.An open-labelpilot study of the combination therapy of metformin and fluoxetine for weight reduction[J].Int J Obes，2007，31（4）：713.

[3]Bugianesi E，Gentilcore E，Manini R，et al.A randomized controlled trial of metformin versus vitamin E or prescriptive diet in nonalcoholic fatty liver disease[J].Am J Gastroenterol，2005，100（5）：1 082.

[4]Aguiar LG，Bahia LR，Villela N，et al.Metformin improves endothelial vascular reactivity in first degree relatives of type 2 diabetic patients with metabolic syndrome and normal glucose tolerance[J].Diabetes Care，2006，29（5）：1 083.

[5]Nawrocka J，Starczewski A.Effects of metform in treatment in women with polycystic ovary syndrome depends on insulin resistance[J].Gynecol Endocrinol，2007，23（4）：230.

[6]刘学红，王本杰，郭瑞臣.复方盐酸二甲双胍片人体生物等效性研究[J].中国药房，2005，16（1）：44.

[7]余继英，何 林，吴正中，等.盐酸二甲双胍的体内过程及临床应用[J].职业卫生与病伤，2002，17（4）：300.