HPLC法测定甲氧苄啶片主药及有关物质的含量

池秀珍（福建泉州市药品检验所，泉州市 362000）

甲氧苄啶为一种广谱、高效、低毒的抗菌增效剂[1]，其制剂甲氧苄啶片收载于《中国药典》2005年版二部中。该标准[2]中含量测定采用紫外分光光度法，其原料药项下有关物质检查采用薄层色谱法，但甲氧苄啶片项下未对有关物质进行控制。为了更全面的控制甲氧苄啶片的质量，笔者建立了高效液相色谱（HPLC）法同时测定甲氧苄啶片中主药及有关物质的含量。结果表明，该法简便、准确，专属性强，可用于甲氧苄啶片的含量测定及有关物质的检查。

1 仪器与试药

1100系列HPLC仪、色谱工作站（美国Agilent公司）。

甲氧苄啶标准品（中国药品生物制品检定所，批号：100031-200304，供含量测定用）；甲氧苄啶片（广东台城制药有限公司，批号：20081001、20090402；江苏永大药业有限公司，批号：20060303。规格均为每片100 mg）；乙腈为色谱纯，磷酸、三乙胺均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件及系统适用性试验

色谱柱：Waters symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：0.015 mol·L－1磷酸（用三乙胺调pH至3.5）-乙腈（83∶17)；流速：1 mL·min－1；柱温：30 ℃；检测波长：271 nm；进样量：10 μL。取“2.2”项下标准品溶液、供试品溶液与阴性对照溶液进样分析，结果在上述色谱条件下，理论板数按甲氧苄啶计为11 053，阴性对照溶液不干扰测定。色谱见图1。

2.2 溶液的制备

图1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatography

2.2.1 标准品溶液。精密称取甲氧苄啶标准品（105℃干燥3 h）20 mg置于25 mL容量瓶中，加0.01 mol·L－1HCl溶液适量，超声使溶解，稀释至刻度，摇匀，作为标准品贮备液。精密吸取贮备液5 mL，置于50 mL容量瓶中，用0.01 mol·L－1HCl溶液稀释至刻度，摇匀。

2.2.2 供试品溶液与阴性对照溶液。取本品20片，精密称定，研细，精密称取适量（约相当于甲氧苄啶80 mg）置于100 mL容量瓶中，加0.01 mol·L－1HCl溶液适量，超声使溶解，并稀释至刻度，摇匀，滤过。精密吸取续滤液5 mL，置于50 mL容量瓶中，加0.01 mol·L－1HCl溶液至刻度，摇匀，作为供试品溶液；另按处方比例称取空白辅料适量，同法制成阴性对照溶液。

2.3 专属性试验

分别取本品细粉适量，分置于4个10 mL具塞试管中，1份加入0.01 mol·L－1HCl溶液10 mL摇匀后于4 500 Lx光照48 h；1份加3%H2O2溶液10 mL摇匀后于80℃水浴1 h；另2份分别加入1 mol·L－1HCl溶液10 mL、3 mol·L－1NaOH溶液10 mL于80℃水浴2 h。精密吸取各条件下破坏后的样品溶液各1 mL，分置于10 mL容量瓶中（经酸、碱破坏的样品在稀释前先中和），加0.01 mol·L－1HCl溶液至刻度，摇匀。取上述各溶液，照“2.1”项下的色谱条件，分别进样10 μL，记录色谱至主峰保留时间的4倍。结果，供试液在氧化破坏条件下产生的降解产物峰最多，其他破坏条件下也均有不同程度的降解产物产生。在此色谱条件下，甲氧苄啶与其相邻降解产物峰都能达到有效分离，降解产物不干扰样品的测定，色谱见图1。

2.4 线性关系考察

精密吸取标准品贮备液0.2、0.6、1.0、1.4、2.0 mL分别置于10 mL容量瓶中，用0.01 mol·L－1HCl溶液稀释至刻度，摇匀，得系列标准品溶液。分别取上述溶液各10 μL注入色谱仪，照“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱。以标准品的浓度（C）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得线性方程为Y＝11.658 6C+4.298 7（r＝0.999 9，n＝5）。结果表明，甲氧苄啶检测浓度线性范围为16.1～161.3 μg·mL－1。

2.5 精密度试验

取“2.4”项下标准品溶液（80 μg·mL－1），连续进样5次，测定峰面积，结果峰面积的RSD＝0.1%。

2.6 重复性试验

取同一批样品（20081001）6份，照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件试验，测得其平均含量为99.6%，RSD＝0.3%。

2.7 稳定性试验

取“2.6”项下的供试品溶液，室温放置，分别于0、2、4、8、12、24 h时进样10 μL，结果其峰面积的RSD＝0.5%。表明供试品溶液在室温放置24 h内稳定。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的样品9份，按高、中、低浓度加入不同量的标准品各3份，照“2.1”项下色谱条件测定，计算回收率，结果见表1。

2.9 最低检测限与定量限

取标准品溶液逐级稀释、测定，按信噪比（S/N）为3∶1，测得最低检测限为3.8 ng；按信噪比（S/N）为10∶1，测得定量限为13.9 ng。

2.10 样品中主药及有关物质含量测定

取不同生产厂家的样品3批，按“2.2”项下方法制备供试品溶液、标准品溶液，照“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱，按外标法以峰面积计算含量，并与《中国药典》记载的紫外分光光度法测定结果进行比较。

精密称取本品细粉适量，用0.01 mol·L－1HCl溶液制成每1 mL含0.8 mg的溶液，滤过，取续滤液作为供试液；精密吸取供试液1 mL，用0.01 mol·L－1HCl溶液制成每1 mL含0.008 mg的溶液作为对照溶液。取对照溶液10 μL，注入色谱仪，调节仪器检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高约为满量程的20%～25%，再精密吸取供试液与对照溶液各10 μL，分别注入色谱仪，记录色谱至主成分峰保留时间的2倍，供试液如有杂质峰，按主成分自身对照法计算杂质总量，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积(1.0%)。

表1 回收率试验结果（n＝9）Tab 1 Result of recovery test（n＝9）

主药及有关物质含量测定结果见表2。

表2 样品中主药及有关物质含量测定结果（%%）Tab 2 Content determination of trimethoprim and its related substances（%%）

由表2可见，本文建立的主药含量测定方法与药典法比较结果无差异。

3 讨论

笔者参考了相关文献[3～5]，比较了不同比例、不同pH的乙腈-磷酸溶液以及甲醇-0.1 mol·L－1磷酸二氢钾溶液作为流动相系统时的分离效果。结果以0.015 mol·L－1磷酸（用三乙胺调pH至3.5）-乙腈（83∶17）为流动相时，甲氧苄啶色谱峰峰形最好，保留时间适中（5.7 min），主峰与其相邻的杂质峰能有效分离，溶剂、辅料均不干扰测定。

[1]张 伦.甲氧苄啶的应用、生产和市场状况[J].中国药房，2001，12（3）：143.

[2]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（二部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：118.

[3]国家药典委员会编.国家药品标准化学药品[S].第十三册.2002，12：108.

[4]韩志云，朱迎春.HPLC法测定头孢氨苄甲氧苄啶胶囊含量的方法改进[J].海峡药学，2007，19（1）：48.

[5]谢 燕，陈 明，肖艳萍.高效液相色谱法测定甲氧苄啶氯化钠注射液中甲氧苄啶的含量[J].精细化工中间体，2006，36（4）：63.