结核病与BCG疫苗接种个体Taq Man探针荧光定量PCR诊断方法的建立及初步应用

王春雨，杨 莉，王振国，刘金华，宋占昀，周 亮，王宝任，王全凯*

(1.吉林农业大学，吉林长春130118；2.吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心，吉林长春130062；3.长春净月开发区玉潭镇政府畜牧站，吉林长春130322)

世界1/3人口感染过结核杆菌(Tubercle bacillus)[1]，结核菌素皮肤试验(Tuberculin skin test，TST)是临床检测T.bacillus的主要方法，该方法使用的结核菌素含有200种以上的抗原蛋白，这些抗原广泛存在于致病性T.bacilla、卡介苗(BCG)和环境中的其他分支杆菌(M ycobacterium)中，使得结核菌素与非致病性分枝杆菌的抗原存在交叉反应，因此检测结果中经常出现假阳性现象[2-3]。

结核病的主要病原菌为人型结核杆菌和牛分枝杆菌(M.bovis)[4-5]，因此控制牛分枝杆菌病的流行对人类结核病的防制是十分必要的，传统的人型结核杆菌与牛分枝杆菌的鉴别检测主要依靠生化试验，随着变异株的出现，生化检测的特异性降低，同时由于结核杆菌复合群(MTC)生长较慢，使得MTC物种级鉴定依然存在较大难度[6-7]。因此，分子检测已经成为实验室检查的常规手段之一，本研究根据致病性结核杆菌特有的RD1序列区间、牛分枝杆菌229bp序列以及人型结核杆菌12.7kb插入序列，分别设计合成特异性引物及探针，利用Taq Man探针荧光定量PCR对病原菌进行检测，建立人畜共患结核病快速鉴别诊断方法。

1 材料和方法

1.1 标准菌株 结核分枝杆菌(M.tuberculosis)标准株 H37Rv(ATCC25618)、H37Ra(ATCC25177)、牛分枝杆菌(ATCC19210)、卡介苗(BCG，ATCC27289)、草分枝杆菌(M.phlei，ATCC607)、大肠杆菌O157(E.coli，ATCC607)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis，ATCC607)，胃分枝杆菌(M.gastri，ATCC15754)和副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis，ATCC43015)均购自北京中原经贸公司(ATCC菌种保存中心中国代理)。

1.2 主要试剂和仪器 Ex Taq酶购自TaKaRa公司；7H10和7H9培养基均购自BD公司；ABI7000实时荧光PCR仪为ABI公司产品；超纯水器M ill-Q Elix 10为M illipore公司产品。

1.3 引物和探针的设计与合成 应用Primer Express2.0软件设计荧光定量PCR探针和引物。根据GenBank登录的TB RD1编码区设计合成引物及探针(MTC1)，探针5'端标记FAM荧光基团，引物3'端标记BHQ-1，上游引物：GGCTTCTGACCCGCTA ATAC，下游引物：ACGTGACATTTCCCTGGATT，MTC1：CCGCGAAATTCCACTGCTGC，扩增产物大小为111bp；根据GenBank登录牛分枝杆菌基因组中特有序列(AJ003103)设计合成引物及探针(B1)，探针5'端标记HEX荧光基团，引物3'端标记BHQ-1，上游引物：TAATGTGCGAGCTGAGCGA TG，下游引物：GTAGCGAGTCGAGCGTGTAAT，B1： TGAATTCATACAAGCCGTAGTCGTGCA， 扩增产物大小为123bp；根据GenBank登录的人型结核分枝杆菌基因组12.7kb插入序列(BX842576)设计合成引物及探针(M 1)，探针5'端标记TET荧光基团，引物3'端标记BHQ-1，上游引物：TCGGAAT AAGATGTCAGGCA，下游引物：CGTCTGAAATC GTTGGACAC，M 1：CGACTCGCGGCATTCAGCAT，扩增产物大小113bp。

1.4 Taq Man探针荧光定量PCR 按常规方法提取细菌基因组DNA，Taq Man 25μL荧光定量PCR反应程序为：95℃ 4min；95℃ 15s、60℃ 30s，40个循环；退火延伸时检测荧光信号。3对扩增引物和相应探针的反应体系及程序相同。

1.5 特异性试验 按照常规方法，分别提取对照标准菌株DNA进行荧光定量PCR扩增和普通PCR扩增，同时设置阳性对照，检测本方法的特异性。

1.6 敏感性试验 提取质控菌株DNA，用灭菌生理盐水稀释，使其浓度依次为109pg/m L、108pg/m L、107pg/m L、106pg/m L、105pg/m L、104pg/m L、103pg/m L、102pg/m L、101pg/m L和1pg/m L，用于灵敏性试验，同时与普通PCR检测方法进行比较[9]。

1.7 标准曲线建立 将阳性质粒稀释成103copies/μL～107copies/μL浓度梯度，在最佳反应条件下同时扩增。反应结束后计算机自动绘制标准曲线。

1.8 重复性试验 同一样品在相同条件下进行3次组内PCR扩增试验，测定该方法的重复性。

1.9 临床样本检测 分别采集PPD试验为阳性、阴性鹿血样本进行荧光定量PCR检测。

2 结果

2.1 特异性试验 经过普通PCR和荧光PCR扩增检测，致病性结核杆菌复合群引物对H37Rv、H37Ra、牛分枝杆菌呈阳性结果，其它样品为阴性；牛分枝杆菌检测对H37Rv、H37Ra呈阴性结果，牛分枝杆菌变现为阳性；结核分枝杆菌引物检测H37Rv、H37Ra出现扩增曲线，牛分枝杆菌和BCG为阴性，研究结果显示，3种荧光探针PCR检测方法都具有较好的特异性(图1、图2)。

2.2 敏感性试验 取结核分枝杆菌H37Rv各稀释度样品3μL进行荧光PCR检测试验，结果显示，致病性结核杆菌复合群荧光PCR的检测灵敏度可达每个反应1pg(图3)，分别取结核分枝杆菌H37R v和牛分枝杆菌各稀释度样品3μL，对结核分枝杆菌及牛分枝杆菌荧进行光PCR检测，其敏感度也可达到1个菌细胞。通过实验证明本研究建立的荧光探针PCR检测方法其灵敏度高于普通PCR(灵敏度为10pg/m L)。

2.3 标准曲线图的建立 分别将克隆的H37Rv和M.bovis的阳性质粒稀释成103copies/μL～108copies/μL浓度梯度，在最佳反应条件下同时扩增，得出准曲线，其中结核分枝杆菌复合群PCR检测的R2值达到了0.9998(图4)，牛分枝杆菌PCR检测的R2值达到了0.9988，人型分枝杆菌PCR检测的R2值达到了0.9991，说明本研究制备的标准品符合试验要求，所建立的检测方法是合格的。

2.4 重复性试验 分别取H37Rv和M.bovis进行3次组内重复扩增实验，检测致病性结核杆菌复合群荧光PCR(图5)、牛分枝杆菌荧光PCR重复性及结核分枝杆菌荧光PCR的重复性，结果表明3种荧光探针PCR检测方法重复性好、稳定可靠。

2.5 临床样品检测试验 在吉林部分鹿场进行PPD检查，采集的鹿血样本进行检测。PPD试验和荧光探针PCR对临床样本检测结果(表1)。结核杆菌复合群荧光探针PCR检测结果中，全部95份样品中阳性样品43份，其中牛分枝杆菌34株，人型结核杆菌9株，未发现BCG疫苗株(图6)。

表1 PPD试验和荧光探针PCR对临床样本检测结果的比较Table 1Comparison of PPD test and Fluorescent Taqman PCR in clinical samples

3 讨 论

本研究建立的荧光Taq Man PCR检测方法的特异性和敏感性均高于PPD检测，对BCG接种和环境中分枝杆菌引起的假阳性能够鉴别检测，并对病原菌直接进行种的鉴定，可以为TB的治疗和流行病学研究提供可靠数据。

目前，TB的检测靶序列主要是32ku、38ku和65ku抗原蛋白的编码基因，以及dnaJ基因、groE1基因和IS6110插入序列等[8]，其中IS6110插入序列是研究较为广泛的目的基因，在人型结核杆菌中其含有4个～20个拷贝，但是在大部分牛分枝杆菌中含有0～5个拷贝[9-10]，所以基于IS6110位点的PCR检测方法在动物TB的研究较少。近年来研究发现结核杆菌复合群的ESAT-6和CFP-10蛋白的编码序列只存在于致病性结核杆菌中，BCG中缺失该序列[11-12]，将该序列作为目标靶序列，开发具有高度敏感性和特异性的TB荧光PCR鉴别检测技术，对TB检疫、控制乃至根除具有十分重大的经济效益和社会效益。此外，本研究建立的方法可以特异性检测牛分枝杆菌和人型结核杆菌，对促进动物结核病与人结核病的相互关系研究具有重要意义。

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