重组大肠杆菌K88ab和K99蛋白制备的鸡卵黄抗体的效力评价

刘文鑫，冯瑜菲，杨旭东，胡文霞，师东方

(东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨150030)

仔猪黄痢和仔猪白痢是由产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)引起的，以严重腹泻和脱水为特征的仔猪常见传染病，常导致哺乳仔猪死亡，造成严重的经济损失[1]。ETEC带有的黏附素性菌毛，可黏附于宿主的小肠上皮细胞，定居和增殖，产生致病作用[2]。ETEC菌毛主要有F4(K88)、F5(K99)、F41和 F6(987P)4种[2-3]，其中以带有K88和K99菌毛抗原的ETEC最为常见[4]。目前，预防仔猪黄痢和仔猪白痢的主要措施是用大肠杆菌K88、K99、987P多价疫苗免疫母猪，使哺乳仔猪获得被动免疫保护。近年来，以K88和K99菌毛为免疫原制备的高免卵黄抗体对该病良好的防治效果也得到了临床证实[4-5]。以往制备的高免卵黄抗体均以提取的天然菌毛为免疫原，不仅成本高，操作复杂，在培养和增殖过程易造成病原菌扩散。

本研究以重组大肠杆菌K88ab和K99蛋白为免疫原制备了具有良好预防和治疗效果的鸡卵黄抗体，为仔猪黄痢和仔猪白痢卵黄抗体的制备探索新的有效方法。

1 材料和方法

1.1 菌株、实验动物及主要试剂 大肠杆菌C83529(O141：K99)、C83915(O9：987P)、C83903(O141：K88ab)及 C83684(O139：F18ab)参考菌株，以及K88和K99单因子血清均购自中国兽医药品监察所。pColdⅠ载体由本单位王君伟教授提供。油乳剂由哈尔滨生物疫苗有限公司提供。实验用新生仔猪由黑龙江省青冈县某种猪场提供，常规条件饲养。培养基按《中国兽药典》配制。

1.2 免疫原制备与鉴定 根据GenBank中登录的K88ab(M 29374)和K99(M 35282)基因序列，设计并合成特异性引物(K88ab-P1：GGATCCACTCTGATT GCACTGGCAATTGC；K88ab-P2：AAGCTTAGTAA TTGCTACGTTCAGCGGAGC。 K99-P1： GGATCCG GTACTATTAACTTCAATGGC；K99-P2：AAGCTTT AAGTGACTAAGAAGGATGC)。

分别以大肠杆菌C83903、C83529DNA为模板，扩增不含信号肽的K88ab(852bp)基因和K99基因(479bp)，并克隆于表达载体pColdⅠ，转化Rosetta感受态细胞进行诱导表达。经SDS-PAGE分析后经western blot对表达产物进行鉴定。测定蛋白浓度，保存备用。

参照文献[6]的方法提取K88ab及K99天然菌毛。用SDS-PAGE和western blot进行分析鉴定。测定蛋白浓度，保存备用。

参照文献[7]的方法制备油乳剂免疫抗原，并按200u/m L的量加入双抗。

1.3 卵黄抗体的制备 将制备的免疫原(1：K88ab菌毛蛋白、2：K88ab重组蛋白、3：K99菌毛蛋白、4：K99重组蛋白)参照相关文献的免疫剂量[7-9]，按低(A：0.25mg/只)、中(B：0.5mg/只)、高(C：0.75mg/只)3个免疫剂量对9月龄海兰蛋鸡进行首次免疫。每种免疫原免疫9组。首免后14d和28d分别进行二免和三免。二免将一免时每种免疫原的每个免疫剂量继续划分为低、中、高3个免疫剂量进行免疫。二免后随机选取某天收蛋并用试管凝集法检测各组抗体效价，选出效价较高的组作为优势剂量组，三免仅将一免时的优势剂量组(高剂量组)和二免时的低、中、高剂量组分别进行高剂量的加强免疫，其他免疫组弃去。以K88和K99单因子血清的试管凝集价1∶640作为临界标准，待卵黄抗体效价达到要求后，收蛋并用优化的水稀释-辛酸法大量提取卵黄抗体。

1.4 卵黄抗体安全检验 按《中国兽药典》附录中对相关生物制品的标准，对提取的卵黄抗体进行物理性状检验、无菌检验、支原体检验及小鼠皮下注射实验[10]。

1.5 卵黄抗体特异性检验 参照文献[11]，将氯仿法提取的卵黄抗体分别与 K88ab+、K99+、987P+、F18+大肠杆菌做玻板凝集试验。灭菌生理盐水为阴性对照，K88和K99单因子血清为阳性对照。

1.6 卵黄抗体效价检测 用试管凝集方法，以培养18h的大肠杆菌菌液作为抗原，用氯仿抽提法提取各组卵黄抗体进行检测，确定各组抗体效价[12]。将卵黄抗体于-20℃条件下储存4个月，利用试管凝集方法检测其抗体效价。

1.7 卵黄抗体效力评价

1.7.1吸附及吸附抑制实验参照文献[12]和[13]的方法制备仔猪小肠上皮细胞悬液，用未处理的大肠杆菌及用卵黄抗体处理过的大肠杆菌与上皮细胞作用，涂片固定后，用革兰氏染色法染色，油镜观察吸附及吸附抑制情况。

1.7.2预防实验取同期新生健康仔猪6窝，每窝(10头～13头)平均分成2组，分别灌服试管凝集效价≥1∶640的1∶9稀释的高免卵黄液和经水稀释-辛酸法粗提的卵黄抗体，每头猪每天灌服一次(5m L/次)，出生后每周前3d灌服，连续3周。6窝仔猪分别灌服抗重组K88ab蛋白卵黄抗体、抗重组K99蛋白卵黄抗体、抗K88ab菌毛卵黄抗体、抗K99菌毛卵黄抗体、抗重组K88ab+K99蛋白卵黄抗体及抗K88ab+K99菌毛卵黄抗体。以同期出生的其它仔猪对照。逐天观察预防效果。

1.7.3治疗试验选取临床确诊为仔猪黄痢和仔猪白痢的各日龄仔猪共70只，分别口服抗K88ab和K99菌毛的混合高免卵黄液及水稀释-辛酸法粗提的卵黄抗体，每天5m L，连续3d，观察治疗效果。

2 结果

2.1 免疫原鉴定 重组表达载体的测序结果显示，扩增并插入表达载体的K88ab和K99基因与Gen-Bank中登录的序列同源性达100%。经SDS-PAGE及western blot分析，表达的重组大肠杆菌K88ab和K99蛋白大小约30ku和19.6ku，提取的K88ab和K99天然菌毛蛋白大小约28ku和14ku，均与预期大小一致(图1)。经测定重组大肠杆菌K88ab和K99蛋白浓度分别为5.36mg/m L和3.02mg/m L，提取的K88ab和K99天然菌毛蛋白浓度分别为1.64mg/m L和2.56mg/m L。

2.2 卵黄抗体特异性检验 平板凝集试验结果显示，抗K88ab卵黄抗体与C83903(K88ab+)出现颗粒状凝集，抗K99卵黄抗体与C83529(K99+)出现颗粒状凝集，与阳性对照相符。与987P+、F18+大肠杆菌及生理盐水均未出现任何凝集现象。

2.3 卵黄抗体安全检验 制备的卵黄抗体为略带白色的澄清液体，无沉淀、凝块、絮状物。在相应培养基上均无细菌、霉菌及真菌生长，昆明鼠皮下注射卵黄抗体10d后均未见不良反应，表明制备的卵黄抗体安全性良好。

2.4 制备的卵黄抗体效价检测 一免时4种免疫原的高剂量子在二免后效价最高(图略)，仅将此组做第三次加强免疫。三免后1周卵黄抗体的试管凝集价最高可达1∶1280。三免后3周卵黄抗体试管凝集价最高为1∶2560。三免后5周卵黄抗体效价降至临界水平(图2)。抗体效价在临界值以上的持续时间为1个月。

提取的卵黄抗体于-20℃条件下储存4个月后，试管凝集价为1∶2560。效价无明显变化。

2.5 体外吸附与吸附抑制实验 油镜观察显示，用相应卵黄抗体处理前大肠杆菌C83529(K99+)和C83903(K88ab+)能明显的吸附于仔猪小肠上皮细胞(图3a～3b)，用相应卵黄抗体处理后大肠杆菌丧失了吸附小肠上皮细胞的能力(图3d～3g)。

1:The purified recombinant K99protein;3:The purified recombinantK88ab protein;4:The fimbriae of E.coli C83903(K88ab+);6:The fimbriae of E.coli C83529(K99+);2,5,7:Molecularweight Marker(12ku-80ku);8:K88ab pili from E.coli C83903(K88ab+);9:Expression product of K88ab protein;11:K99pili from E.coli C83529(K99+);12:Expression productof K99protein;10,13:MolecularweightMarker(12ku-80ku)

图2 三免后卵黄抗体效价检测Fig.2Detection of egg yolk antibody titer post 3rd immunication

2.6 预防试验 在预防试验的3周内，灌服卵黄抗体的仔猪精神状态良好，除灌服抗K99蛋白卵黄抗体组有6头在灌服的前2周发生腹泻外，其余各组均未发生腹泻。预防有效率为100%，保护率为91%(64/70)。

a:E.coli C83903(K88ab+)attachment to epithelial cells of new piglets;b:E.coli C83529(K99+)attachment to epithelial cells of new piglets;c:Negative control;d:Anti-attachmentof K88ab pilus egg yolk antibody to epithelial cells of new piglets;e:Anti-attachment of K88ab protein egg yolk antibody to epithelial cells of new piglets;f:Anti-attachmentof K99pilus egg yolk antibody to epithelial cells of new piglets;g:Anti-attachmentof K99protein egg yolk antibody to epithelial cells of new piglets

2.7 治疗试验 对临床确诊为仔猪黄痢和仔猪白痢的仔猪灌服卵黄抗体3d后，仔猪腹泻症状减轻或消失。治疗有效率为100%，治愈率为87%(61/70)。

3 讨 论

目前，对仔猪黄痢和仔猪白痢的治疗和预防措施主要有母猪免疫接种E.coli多价疫苗和抗生素疗法[12]，但由于抗生素的滥用，导致耐药菌株的不断出现而影响治疗效果[5]，而用疫苗免疫母猪，通过初乳被动免疫保护仔猪的方法也因不同母猪初乳中抗体水平不一致，仔猪摄入初乳不足等因素，使免疫保护效果不理想[14-15]。因此，探索更加有效预防和治疗仔猪黄痢和仔猪白痢的方法成为关注的热点。

由于卵黄抗体具有产量大、易于制备、稳定性好、对哺乳动物抗原有高亲合力、无同源动物病原体的存在和传播等优点[14-15]，许多学者相继研制和开发了针对不同病原的高免卵黄抗体用于临床预防和治疗。用于仔猪黄痢和仔猪白痢预防和治疗的卵黄抗体也显示了良好的开发前景[16]。目前针对ETEC菌毛的卵黄抗体，其免疫原均是提取的天然菌毛[16-17]。尽管天然菌毛是良好的免疫原，但制备成本高，操作烦琐，易造成病原菌扩散。本研究结果显示，用重组蛋白作为免疫原，具有成本低，易于纯化的优点，所制备的卵黄抗体与用天然菌毛制备的卵黄抗体相比，对仔猪黄痢和仔猪白痢同样具有良好的预防和治疗效果。该研究为仔猪黄痢和仔猪白痢卵黄抗体的规模化生产提供了实验依据。

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