赵元珍,高春芳
腹部受辐射致严重的急性放射性肠炎,在平、战时均可发生,可导致绒毛破坏,黏膜糜烂,影响食物的消化吸收,并可导致肠道细菌易位,目前尚无有效的治疗方法。本实验探讨谷氨酰胺对大鼠急性放射性损伤后肠细菌易位的影响,并探讨其作用机理。
1.1 动物模型及分组 正常SD雄性大鼠30只,体重200~250 g。实验大鼠在照射前禁食12~14 h,用0.5%戊巴比妥钠(0.8 ml/100 g体重)腹腔麻醉,一次性用60Co放射治疗仪给予全腹部照射8 Gy,然后经常规消毒后,行右颈静脉插管术,建成急性放射性肠炎全肠外营养大鼠模型,进行持续7 d的全肠外营养。实验动物随机分为三组:①正常组(n=10)为未经腹部照射的正常大鼠,作为正常对照;②常规全肠外营养组(STD组,n=10):大鼠输入不含有谷氨酰胺的静脉营养液;③谷氨酰胺组(GLN组,n=10):大鼠输入含3%丙氨酰-谷氨酰胺 (相当于2%谷氨酰胺)的静脉营养液。后两组静脉营养液的含氮量和非蛋白热卡均相同。
1.2 检测指标 连续7 d全肠外营养后,在取材前1 h,经颈静脉(正常组大鼠经阴茎背静脉)注入5-溴脱氧尿苷(BrdU;Sigma公司产品),剂量为50 mg/kg体重[1](BrdU 浓度为 5 mg/ml,双蒸水配制,置于冰箱内备用),1 h后,动物麻醉后,取相应肠段,测定空、回肠组织内蛋白质和DNA的含量。剖腹取相应空肠和回肠,固定于10%的中性甲醛中,固定24 h,常规石蜡包埋,切片厚5 μm。常规切片HE染色,免疫组织化学染色采用ABC法,抗-BrdU(美国Sigma公司)。常规切片光镜下观察肠隐窝细胞有丝分裂象并计数,免疫组化切片光镜下观察被BrdU标记的阳性细胞,在小肠上皮细胞中分布的位置,并用文献[2]的方法,计数每个隐窝内阳性细胞数,以整个细胞核染色为阳性细胞进行统计。每组采用4只大鼠,每只动物的小肠组织采用3张非连续切片,每张切片随机取中间部位的8~10个隐窝,计数每个隐窝内细胞有丝分裂象和免疫组化标记的阳性细胞数,并进行统计学分析。
1.3 病理学观察 取3个组大鼠回肠取回盲部近端20 cm中部,常规石蜡包埋切片,HE染色。光镜下观察回肠黏膜病理变化,用VIDS半自动图像分析仪(Olivetti,M24 型,英国 AMS 公司生产),随机全盲对每个标本测量不同部位完整的绒毛高度、隐窝深度、黏膜厚度和肠壁全层厚度。
1.4 电镜观察 透射电镜的标本,先切成1 cm3大小的组织块,固定于2.5%的戊二醛中,用Epon812包埋。透射电镜下观察,随机和选择摄片,回肠上皮细胞的照片,用VIDS半自动图像分析系统测定回肠上皮细胞微绒毛的高度,并比较细胞内线粒体的变化。
1.5 肠道内细菌易位的检测 在严格无菌的条件下,剖腹取回盲部链状淋巴结2枚,剪碎后置于葡萄糖蛋白胨试管内,37℃条件下培养48 h,接种于普通血平板培养基上,培养24 h行细菌定性检查,以检出大肠杆菌或革兰阴性杆菌作为阳性结果。
表 1 3组大鼠空、回肠DNA和蛋白质含量(mg/5 cm,±s)
表 1 3组大鼠空、回肠DNA和蛋白质含量(mg/5 cm,±s)
与正常对照组比较,*P<0.05;与STD组比较,#P<0.05
n 空肠 回肠蛋白质 DNA 蛋白质 DNA正常对照组 6 108.60±23.53 10.13±1.46 104.35±11.87 9.68±1.70 STD 组 6 70.25±16.39* 6.26±1.56* 66.89±13.33* 5.87±1.98*GLN 组 7 93.26±19.67# 8.98±2.79# 91.32±18.77# 8.45±2.13#
表 2 大鼠小肠隐窝细胞有丝分裂数(个/隐窝,±s)
表 2 大鼠小肠隐窝细胞有丝分裂数(个/隐窝,±s)
与正常对照组比较,*P<0.05;与STD组比较,#P<0.05
n 空肠 回肠正常对照组 6 3.16±0.89 2.56±0.38 STD 组 6 3.76±0.87 3.34±0.74 GLN 组 7 6.98±1.07*# 5.55±0.89*#
2.1 空、回肠组织蛋白质和DNA含量 正常对照组空、回肠蛋白质和DNA的含量均明显高于另两组。谷氨酰胺组(GLN组)组空、回肠蛋白质和DNA的含量明显高于常规对照组(STD组),见表1。
2.2 光镜下观察 STD组小肠绒毛高度和隐窝深度降低,肠隐窝细胞有丝分裂象少见,GLN组绒毛高度和隐窝深度较大,隐窝细胞有丝分裂象多见;3组小肠隐窝细胞有丝分裂象计数统计,显示GLN组细胞有丝分裂明显多于其它各组,见表2。
2.3 BrdU标记细胞观察计数 正常对照组、STD组和GLN组小肠上皮细胞内BrdU标记的细胞呈棕黄色,底色几乎呈无色,阳性细胞很容易辨认,阴性对照片均为阴性。三个组BrdU阳性细胞均位于空、回肠黏膜层的肠腺内,主要为肠腺基底部的上皮细胞,胞核呈棕黄色中度阳性反应,绒毛上皮细胞内为阴性,观察BrdU的阳性细胞的分布,发现GLN组的小肠上皮细胞内的阳性细胞数多于STD组,统计分析表明GLN组小肠BrdU阳性细胞数多于STD组(P<0.05),而GLN组和正常对照组两者无显著性差异(P>0.05),见表 3。
表3 小肠BrdU阳性细胞数(个/隐窝,±s)
表3 小肠BrdU阳性细胞数(个/隐窝,±s)
与STD组比较,*P<0.05
n 空肠 回肠正常对照组 6 11.17±4.56 10.47±3.98 STD 组 6 7.76±2.23 6.53±2.07 GLN 组 7 12.53±3.68* 11.67±3.97*
2.4 回肠的形态学观察 肉眼观察:STD组回肠壁水肿明显,黏膜出血点多且密集,伴有程度不等的糜烂,而GLN组小肠壁水肿较轻,黏膜出血点少。光镜下观察:STD组小肠绒毛局部坏死脱落形成糜烂(8/10例),尤以回肠为甚(9/10例),脱落的上皮细胞局部形成“伪膜”样结构,绒毛高度和隐窝深度降低,GLN组绒毛完整(8/10例),绒毛高度和隐窝深度较大。经半自动图像分析作定量测定,GLN组回肠绒毛高度、隐窝深度、黏膜及全层壁厚度均显著大于STD组,见表4。
表 4 回肠的形态学参数测量结果(μm,±s)
表 4 回肠的形态学参数测量结果(μm,±s)
与STD组比较,#P<0.001
组别 绒毛高度 隐窝深度 黏膜厚度 全层厚度正常组 275.28±12.20 186.30±13.21 465.72±15.35 632.70±17.83 STD 组 258.28±12.69 184.98±13.07 457.96±15.18 604.32±15.39 GLN 组 313.50±11.65#199.74±14.56#519.36±16.89#671.18±17.82#
2.5 小肠电镜观察和测量 透射电镜下可见GLN组小肠上皮细胞微绒毛高度为(966.47±82.36)nm,明显高于STD组的(880.54±176.47)nm。观察上皮吸收细胞内细胞器的变化,发现GLN组细胞内线粒体稍有肿胀,但嵴排列整齐,而STD组细胞内线粒体明显肿胀,甚至嵴断裂。
2.6 肠道内细菌易位率 GLN组肠系膜淋巴结培养细菌易位率为40%(4/10),STD组肠系膜淋巴结培养细菌移位率为 80%(8/10),GLN组显著低于STD 组(P<0.05)。
腹部受辐射损伤导致急性放射性肠炎,致使绒毛破坏,黏膜糜烂,肠黏膜屏障破坏,影响食物的消化吸收,肠道内细菌发生易位,而致毒血症,病死率较高。对急性放射性肠炎缺乏有效的治疗措施,常采用全肠外营养(TPN)支持治疗,使肠道休息待其自然恢复,但长期使用常规全肠外营养后,可导致胃肠道黏膜萎缩,吸收功能受损,肠道内细菌易位增加,血液及组织中GLN含量及小肠对GLN的摄取下降,从而使放射性肠炎的病死率并没有得到显著降低[3]。GLN是小肠黏膜等生长活跃上皮细胞合成嘌呤和嘧啶的供氮体,是其生长、增殖、分化不可缺少的能源物质,对胃肠道黏膜损伤的修复起重要作用。笔者早先已注意到GLN的利用与急性放射性肠炎肠黏膜损伤的修复密切相关[4]。
小肠上皮细胞是对放射性损伤敏感性很高、再生能力很强的组织细胞,受辐射损伤的小肠上皮细胞常由肠腺上皮的未分化细胞增生来补充绒毛的上皮细胞,以逐渐恢复绒毛结构和功能的完整性。GLN是胃肠道黏膜细胞的重要的呼吸能源,是核酸和蛋白质合成的供氮体。在应激状态下,肠上皮细胞的增殖分化更为活跃,在施行TPN时,提供外源性GLN对保证辐射损伤肠上皮细胞DNA和蛋白质更多地合成至关重要[5],本文结果显示,GLN组小肠的各项指标均优于STD组。
利用BrdU标记S期细胞的免疫细胞化学技术,具有简便、重复性好和无放射性等优点。本文结果发现正常组和实验组小肠黏膜内BrdU阳性细胞均位于肠腺上皮细胞内,因为这些细胞是绒毛上皮细胞更新的来源。正常组小肠上皮细胞BrdU阳性细胞位于肠腺内,说明正常小肠上皮细胞增殖的活跃性,对小肠肠腺内BrdU阳性细胞的数目进行计数,结果发现GLN组BrdU阳性细胞数明显多于STD组,该结果表明了GLN二肽可促使急性放射性肠炎大鼠损伤小肠上皮细胞DNA的合成,促使急性放射性肠炎大鼠小肠上皮细胞的分裂增殖。
笔者还采用了透射电镜的观察,结果显示,STD组小肠上皮细胞微绒毛降低和线粒体的结构破坏严重,而GLN组小肠上皮细胞微绒毛明显增高,线粒体破坏较轻,提示GLN可以保护上皮细胞超微结构的完整性。此时微绒毛变化需要线粒体提供的能量,则由GLN提供。而STD组超微结构破坏严重,可能与射线的损伤所致和常规TPN不能提供小肠上皮细胞足够的能量有关。
本研究应用肠系膜淋巴结细菌培养,结果提示STD组肠细菌易位率明显高于GLN组,提示GLN减少肠肠细菌易位机制可能与补充外源性GLN,促进小肠上皮合成DNA和蛋白质,促使受损小肠上皮细胞的修复,保持小肠组织结构的完整性有关[4]。小肠壁结构的完整,才能有效地阻止或减少肠道内细菌的移位。同时也可能与GLN能降低全肠外营养所致的肠黏膜通透性增高有关[5]。
本文结果表明,附加丙氨酰-谷氨酰胺二肽的TPN具有较强的维护胃肠道黏膜抗辐射性损伤的作用,能更好地保护肠屏障功能和防止肠细菌移位的发生。
[1]Tanaka Y,Mak KM,Lieber CS.Immunohistochemical detection of proliferating lipocytes in regenerating rat liver.J Pathol,1990,160(2):129.
[2]Weisgerber WM,Boeingg H,Nernitz R,et al.Proliferation cell nuclear antigen(clon 19A2) correlates with 5-bromo-2-deoxyuridine labelling in human colonic epithelium.Gut,1993,34(4):1587.
[3]Wang JY,Zhang H,Song WL.Epidermal growth factor regulates instestinal glutamine uptake during total parenteral nutrition.Clin Nutr,1996,15(1):21.
[4]赵元珍,高春芳.谷氨酰胺全肠外营养对急性放射性肠炎大鼠消化道营养作用的研究.中华放射医学与防护杂志,2004,24(5):428.
[5]夏国伟,史海安,周亚魁.表皮生长因子、谷氨酰胺强化的全肠外营养对肠屏障功能和肠细菌移位的影响.上海医科大学学报,2000,27(5):443.