姜黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞抑制作用的研究

蓝育青 郑海生 张弛 周怀胜 郭慧

青光眼已成为世界范围内占第二位的不可逆性致盲眼病，而滤过手术是治疗青光眼的重要手段之一，其方法是通过被切除的小梁组织形成一滤过通道，使房水外流从而达到降低眼压，保存残存视功能的目的。但滤过手术存在10%～30%的失败率［1］，其失败的直接原因主要是滤过口处成纤维细胞的增殖、迁移而导致滤过道的纤维瘢痕化，使滤过通道堵塞.这也是青光眼临床与研究中所面临的难题之一，术中应用抗增殖药物如丝裂霉素(mitomycin，MMC)经术后的临床观察可提供手术的成功率，但也存在一定的毒副作用限制其使用。因此许多眼科工作者为防治滤过手术的失败而寻找安全、有效抑制成纤维细胞增殖的方法进行着不懈的努力。姜黄素是一种历史悠久的传统中药，具有多种疗效:抗纤维增殖作用［2］、抑制血管生成［3］、抗肿瘤作用［4］、抗氧化作用［5］、抗炎作用等多种药理作用，且无明显毒副作用具有较好的临床应用前景。目前其在对其他器官和组织的成纤维细胞方面的研究和应用中取得了一定的成果和进展，但在研究姜黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞中的作用还比较少，为研究姜黄素对体外培养的人眼Tenon囊成纤维细胞的抗增殖的作用效果，从而探索防治青光眼手术区滤过泡纤维瘢痕化的新途径，提高青光眼手术成功率。笔者设计以下实验。

1 材料和方法

1.1 材料与主要仪器设备

1.1.1 试剂 CCK-8(Cell Counting Kit-8)(Dojindo公司)、姜黄素(购自SIGMA公司)、vimentin单克隆抗体(博士德公司)、DAB显色试剂(博士德公司)。

1.1.2 主要仪器设备 CO2培养箱(德国Heraeus BB16)、手术显微镜(德国 Zeiss)、光学倒置显微镜(德国 Leica MPS-30)、Wellscan MK3酶标仪(美国 Labsystem Dragon)、

1.2 方法

1.2.1 人眼Tenon囊成纤维细胞的培养、鉴定 眼球结膜下Tenon囊组织标本为中山大学附属第二医院眼科青光眼手术切除组织，采用组织块培养法原代接，第3～6代细胞用于实验。按常规方法培养细胞［6］，并活体显微镜、组织学观察与进行细胞照相。利用盖玻片培养法进行HE染色，并取第3代细胞按免疫细胞化学试剂盒说明书作Vimentin染色鉴定细胞。

1.2.2 CCK-8法检测姜黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞的增殖的影响 实验方法、步骤:①取处于对数生长期的Tenon囊成纤维细胞以10%胎牛血清的高糖DMEM制备为2500个/ml细胞悬液，每孔加入100 μl的细胞悬液分别接种于4块96孔培养板中培养24 h，贴壁;②至细胞长至单层后，分别在细胞中加入终浓度为 10、20、40、80 μg/ml的姜黄素，同时设不加药的阴性对照和只加培养液的空白对照，每组设4个复孔;③再将96孔培养板分别培养24、48、72、96 h后，向每孔中加入10%胎牛血清的高糖 DMEM培养基100 μl及10 μlCCK-8继续放入培养箱内培养3 h;④酶标仪检测450 nm处各孔OD值;每组实验重复3次。

1.2.3 细胞增生抑制率的计算 根据CCK-8的吸光度(A)值计算出细胞增生抑制率并绘制时间、剂量效应曲线。增生抑制率%=(对照组 A值-实验组 A值)/对照组 A值×100%

1.2.4 统计学方法 所有数据用SPSS 11.0软件包处理，实验结果数据计量资料用(±s)表示，CCK-8对人眼Tenon囊成纤维细胞抑制率的浓度和时间关系采用多组定量资料的单因素方差分析进行统计分析。

2 结果

2.1 人眼Tenon囊成纤维细胞的体外培养及生物特性鉴定

2.1.1 体外培养人眼Tenon囊成纤维细胞的形态特征和生物特性 倒置相差显微镜下观察细胞，可见原代培养的组织块约一周后细胞开始从组织块周边游离出来(图1A)，胞体狭长，透亮，胞浆丰富，核圆形、椭圆形。胞膜清晰，呈典型的梭形，繁殖较快，约2～3周细胞增殖基本融合，细胞变长，靠近，呈放射状或漩涡状走行(图1B)。

图1 人眼Tenon囊成纤维细胞原代与传代培养A.原代培养的组织块约6～7 d后细胞开始从组织块周边游离出来B.成纤维细胞胞膜清晰，呈典型的梭形，呈放射状或漩涡状走行

2.1.2 人眼Tenon囊成纤维细胞组织学观察HE染色及免疫细胞化学鉴定 细胞经HE染色，可见细胞呈两头尖的长梭型，不规则。胞核较大，色浅蓝，位于细胞中央;细胞胞浆丰富，色淡红，细胞膜清晰(图2A)。细胞经免疫化学Vimentin染色，可见阳性产物呈棕色，均匀分布于细胞的胞浆中(图2B)。根据组织的取材部位、细胞的形态并结合免疫细胞化学的鉴定可确定实验中所培养的细胞为人眼Tenon囊成纤维细胞。

图2 人眼Tenon囊成纤维细胞HE染色与鉴定A HE染色，呈长梭型，胞核较大，色浅蓝，位于细胞中央;胞浆丰富，色淡红 B经Vimentin染色，阳性产物呈棕色，均匀分布于细胞的胞浆中

2.2 CCK-8法检测姜黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞增殖的影响 CCK-8法检测姜黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞增殖的影响结果见表1，并根据不同浓度姜黄素组在不同时间里对细胞的抑制率绘制时间、剂量效应曲线(图3)。

图3 不同浓度姜黄素组在不同时间里对人眼Tenon囊成纤维细胞的抑制率变化

表1 姜黄素对Tenon囊成纤维细胞增生的影响(±s)

表1 姜黄素对Tenon囊成纤维细胞增生的影响(±s)

注:单因素方差分析表明各实验组与对照组相比，﹡P＜0.01;与临近浓度组比较，△P＜0.01;与临近时间组比较，★P＜0.05

姜黄素浓度(μg/m l)值 生长抑制率0 0.552±0.010 0.660±0.008 1.188±0.032 1.535 24 h 48 h 72 h 96 h OD值 生长抑制率 OD值 生长抑制率 OD值 生长抑制率 OD 97.7±0.023 10 0.498±0.008﹡ 9.8 0.533±0.014﹡★ 19.2 0.602±0.020﹡★ 49.3 0.660±0.009﹡★ 57.0 20 0.430±0.004﹡△ 22.1 0.436±0.016﹡△★ 33.9 0.499±0.011﹡△★ 58.0 0.569±0.012﹡△★ 62.9 40 0.389±0.005﹡△ 29.5 0.385±0.007﹡△★ 41.7 0.212±0.005﹡△★ 82.2 0.078±0.003﹡△★ 94.9 80 0.319±0.011﹡△ 42.2 0.321±0.013﹡△★ 51.4 0.093±0.004﹡△★ 92.2 0.036±0.006﹡△★

即姜黄素浓度≥10 μg/ml时，能抑制人眼Tenon囊成纤维细胞的增殖(P＜0.01)，并随药物浓度的升高、时间的延长，姜黄素对Tenon囊成纤维细胞的抑制强度逐渐加大(P＜0.01)。72 h以上姜黄素对细胞的生长抑制率基本稳定。

3 讨论

青光眼是仅次于白内障的导致视力丧失的主要原因。据流行病学研究资料表明，全球原发性青光眼的患者约超过6680万人，其中约10%失明，因此对青光眼的防治是防盲治盲公共卫生工作的重点之一，具有重大的意义。目前，滤过手术是青光眼治疗的重要手段之一，但有些患者术后却因滤过道的纤维瘢痕化，使滤过通道堵塞而导致手术的失败。通常滤过通道的瘢痕形成中一个主要的原因是:手术创伤刺激手术部位的Tennon囊下间隙使成纤维细胞增殖、移行、释放胶原蛋白，引起纤维血管反应和伤口的收缩，纤维瘢痕形成，导致滤过失败［7］。因此本课题为了探索防治青光眼手术区滤过泡纤维瘢痕化的新途径，提高青光眼手术成功率，设计了此实验。本实验直接从人眼Tenon囊组织中培养出成纤维细胞，其生物学特性符合人眼病变的情况。笔者通过姜黄素作用体外培养的人眼Tenon囊成纤维细胞发现:在0～80 μg/m l浓度作用24～96 h范围内，姜黄素可以抑制人眼Tenon囊成纤维细胞的增长，且呈剂量和时间依赖性。姜黄是一种姜科姜黄属的草本植物，具有多种疗效。Elena等［8］研究发现，姜黄素能够通过抑制蛋白激酶Cε(PKCε)的表达诱导体外培养的硬皮病肺成纤维细胞(scleroderma lung fibroblasts，SLF)发生凋亡。同样高蔚等［9］在研究姜黄素对大鼠肺成纤维细胞(MLF)增殖和凋亡的影响中发现姜黄索对MLF有抑制作用，存在剂量依赖与时间依赖性。本实验所得结果基本上与上述研究发现一致，这说明姜黄素对不同组织中成纤维细胞增殖都有抑制作用。但姜黄素抑制人眼Tenon囊成纤维细胞的分子机制仍不清楚。目前，国内外在对姜黄素抑制各种肿瘤细胞或类肿瘤细胞作用机制研究中发现可能与对细胞信号传导及各种细胞生长因子的影响有关［10］。如可能与下调NF-kappaB，抑制 iNOS、COX-2 活性有关［11］。而姜黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞增殖的抑制是否同样存在相似的机制，这也是下一步需要研究的问题。

在本实验中所用的Cell Counting Kit-8(CCK-8)法评价姜黄素对人眼Tenon囊成纤维细胞的增殖影响是用于测定细胞增殖或毒性试验中活细胞数目的一种高灵敏度，无放射性的比色检测法。其利用了四唑盐-WST-8(2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2，4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)，它在电子载体1-Methoxy PMS存在的情况下能够被还原成水溶性的甲臜染料。CCK-8溶液可以直接加入到细胞样品中;不需要预配各种成分(比较MTT法减少了加DMSO的步骤，从而可进一步减少实验中因操作引起的误差)。WST-8被细胞内脱氢酶生物还原后生成的橙色甲臜染料能够溶解在组织培养基中，生成的甲臜量与活细胞数量成正比。与其他研究体外培养细胞中研究细胞增殖的实验方法相比，CCK-8法检测细胞增殖实验的灵敏度比其他四唑盐如MTT、XTT、MTS或WST-1高、误差小，并且CCK-8溶液相当稳定，对细胞没有毒性，因此可以长时间孵育。因此，CCK-8比色检测法在检测细胞增殖中正成为一种主流方法。

在本实验初步证实了了姜黄素对体外培养的人眼Tenon囊成纤维细胞具有抗增殖作用，为下一步进行动物实验提供了研究基础，同时对姜黄素防治青光眼手术区滤过泡纤维瘢痕化，提高青光眼手术成功率提供了理论依据。

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