环氧化物水解酶产生菌的筛选及其发酵条件的研究

盛艳旻,张正方,王 珊,朱 勍

(浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州310014)

环氧化物水解酶产生菌的筛选及其发酵条件的研究

盛艳旻,张正方,王 珊,朱 勍＊

(浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州310014)

以邻甲氧基苯基缩水甘油醚为唯一碳源,从土壤中筛选具有立体选择性的环氧化物水解酶的真菌,得到一目的菌株层出镰刀菌ZJUZQ010.对其发酵条件进行优化,结果表明:最佳碳、氮源分别是2.0%蔗糖和2.0%黄豆粉,初始p H为4.0;该酶不是诱导酶,2 mmol/L的Zn2+对其细胞生长和酶的诱导激活作用显著;当转化率为59.2%时,剩余R型环氧化物的ee值为93.8%.

环氧化物水解酶;层出镰刀菌ZJUZQ010;邻甲氧基苯基缩水甘油醚;发酵;优化

手性环氧化物及其水解产物邻二醇作为现代手性医药品、农用及精细化学品工业上各种生物活性物质的重要中间体而受到越来越广泛的关注[1-2].其制备方法有化学法和生物法.随着人们环保意识的不断提高,生物制备法将具有广阔的应用前景.

邻甲氧基苯基缩水甘油醚(EM PP)是一种适用性很广的芳基缩水甘油醚.它是β-肾上腺阻滞剂Mop rolol,防心绞痛药物Ranolazine,镇定剂M ephenoxalone,骨骼肌迟缓药物M ethocarbamol及化痰药Guaifenesin等的共同中间体[3].目前已有多种化学和生物方法用于合成光学纯EM PP.但化学法经常需使用重金属元素等有毒物质[4-5],对环境破坏很大,故其应用也受到很大的限制.近年来,用生物催化法制备手性纯化合物得到了较大的发展[6].EM PP含有一个含氧三元环,其结构表明该环氧化物能够通过环氧化物水解酶进行拆分.环氧化物水解酶是一种不依赖于辅因子的酶,其来源广泛,选择性高[6-7],具有很高的工业化应用前景.但目前尚未有关于用环氧化物水解酶拆分EM PP的报道.

该实验室从土壤中筛选出一株能高度对应选择性地水解EM PP的霉菌ZJUZQ010,对其生长和发酵条件进行了优化.

1 材料与方法

1.1 试 剂

实验所用试剂购于浙江杭州华东医药股份公司,分析纯产品.

1.2 菌 种

层出镰刀菌ZJUZQ010由采自不同环境的土样中筛选获得.

1.3 培养基

1.3.1 筛选培养基 每1 000 m l培养基中含有2.0 g NH4NO3,1.5 g Na2HPO4·12H2O,1.5 g KH2PO4·3H2O,0.2 g M gSO4·7H2O,10 mg CaCl2,1.0 mg FeSO4·7H2O,0.1 mg ZnSO4·7H2O, 0.1 g酵母膏和0.1 g玉米粉,p H调节至6.0.250 m l锥形瓶装30 m l培养基,121℃灭菌20 min,冷却后,每瓶加入体积分数为0.2%的邻甲氧基苯基缩水甘油醚.

1.3.2 发酵培养基 每1 000 m l培养基中含有20 g玉米粉,20 g蔗糖,10 g NaCl,p H调节到4.0.

500 m l锥形瓶装60 m l培养基,121℃灭菌20 min.

1.4 实验方法

1.4.1 EM PP的合成[8]

称取1.2 g NaOH(0.03 mo l)加入到20 m l蒸馏水中,再称取2.5 g邻甲氧基苯酚(0.02 mol)加入到上述溶液,将混合物在室温下搅拌约15 min后,逐滴加入7.4 g环氧氯丙烷(0.08 mol)和40 m l甲醇,之后在室温下搅拌.反应完全后,用旋转蒸发器抽去反应物中的甲醇,再用等体积的乙酸乙酯萃取分层的剩余物3次.有机层用饱和NaHCO3和饱和食盐水洗2次后用无水M gSO4干燥,过滤后用真空泵浓缩,得到一种淡黄色油状液体,然后再用柱层析法进行提纯(展开剂:V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)=6∶1),得到一种无色的油状液体(2.95 g,收率81.8%).

1.4.2 筛选 取土样1.0 g,加入100 m l无菌水制成土壤悬浮液,摇20 min后静置.取1.0 m l上清液,加到筛选培养基中,于30℃、200 r/min摇床上培养48 h.取出1.0 m l发酵液至新鲜的筛选培养基,重复前一过程3次后,用接种环沾取培养液,在查氏平板培养基上划线,于30℃恒温培养箱中培养,长出菌落后,挑单一菌落转查氏培养基斜面.

1.4.3 培养

将斜面接种至发酵培养基,于30℃,200 r/min摇床上培养72 h后,纱布过滤,用无菌水冲洗3次,收集菌体,进行转化实验.

1.4.4 转化

将收集的菌体加入15 m l 100 mmol/L,p H8.0的磷酸钾缓冲液中,再加入0.75 m l EM PP的DM SO溶液(体积分数为10%).在30℃,200 r/min摇床上转化30 min,对照不加菌体.

1.4.5 转化率的测定

将菌体转化产物用相同体积的乙酸乙酯萃取3次,取有机层,无水M gSO4干燥,旋转蒸发仪抽干,加入流动相溶解,进行高效液相色谱(HPLC)检测(274 nm波长紫外检测,V(流动相正己烷)∶V(异丙醇)=9∶1, 0.8 m l/min).制定邻甲氧基苯酚浓度标准曲线.以邻甲氧基苯酚作为外标,确定HPLC待测样品中底物环氧化物和产物邻二醇的浓度.

1.4.6 生物量的测定

取发酵液,减压过滤,得菌体后水洗一次,于70～80℃烘干至恒重,称重.实验数据均为3个平行样品的平均值.

2 结果与讨论

2.1 筛 选

实验中以EM PP为唯一碳源进行多轮富集,筛选目的微生物菌株.能以EM PP为唯一碳源进行生长的微生物菌株,理应含有环氧化物(EH)水解酶活性.先进行EH活性检测,再进行下一步的对映体选择性检测.

实验中,在不同的细菌、酵母菌及霉菌中均发现了含有环氧化物水解酶活性的菌株,但含有立体选择性的菌株种类则很少.综合考虑初步测定的转化率及对映体选择性,选取了霉菌菌株ZJUZQ010进行下一步研究.经生理生化及ITS基因序列测序分析,确定该菌株为层出镰刀菌.

2.2 发酵条件优化

培养基成分对菌体细胞成长和成长过程中酶及其合成具有十分重要的影响.因此,该实验对发酵培养基的碳源、氮源、金属离子及其浓度、底物诱导5个方面进行了优化.

2.2.1 碳源优化

在含有2%玉米粉、1%NaCl的基础培养基中分别加入2%不同碳源进行发酵,分离菌体后进行转化,测定转化率和菌体生物量,结果如图1所示.

图1 碳源对菌体转化率和生物量的影响Fig.1 Effect of carbon sources on conversion yield and biomass

碳源种类的比较表明,对于菌株ZJUZQ010,采用不同的碳源时,其生物量和酶活表现出很大的差异.以蔗糖为碳源时,虽然生物量不是最高,但是此条件下发酵获得的菌体其环氧化物水解酶活性有了提高,且此转化率下剩余环氧化物的光学纯度最好.以β-环糊精和甘油为唯一碳源时,虽然EH的活性很高,但此时剩余环氧化物的光学纯度下降.

2.2.2 氮源优化

根据上一步碳源优化的结果,在含有2%蔗糖、1%NaCl的培养基中分别加入2%的不同无机氮源和有机氮源进行发酵,收集菌体后进行转化,测定转化率和菌体生物量.结果如图2所示.

图2 氮源对菌体转化率和生物量的影响Fig.2 Effect of nitrogen sources on conversion yield and biomass

氮源种类的比较表明,若培养基中使用无机氮化合物作为单一氮源,则经过3 d培养后,发酵培养基中基本无菌体生长.这可能是因为生长前期,无机氮源被菌体迅速消耗,不能满足菌体持续生长的需要.而对于有机氮源,该菌体的生物量和酶活表现出较大的差异.以豆饼粉为氮源时,无论生物量还是转化率,都是最高的,玉米粉其次,但两者的转化产物剩余环氧化物的光学纯度较低.而以蛋白胨作为氮源时,虽菌体生物量较大,但其转化率却偏低.因此,从菌体生物量、转化率及剩余环氧化物的光学纯度3个方面考虑后,选择黄豆粉作为该菌株发酵用氮源.

2.2.3 不同金属离子的影响

在发酵培养中分别加入1 mmol/L的不同金属离子,然后进行发酵,收集菌体后进行转化,测定生物量和转化率,结果如图3所示.

图3 金属离子对菌体转化率和生物量的影响Fig.3 Effect of metal ions on conversion yield and biomass

实验结果表明,Fe2+不利于细胞的生长,但是转化率却明显提高.Ba2+和Ca2+能提高菌体生物量,但是该条件下的转化率却下降了.在实验的8种金属离子中,除Fe2+外,Zn2+、A l3+和Cu2+条件下获得的菌体其转化能力也有明显提高,但生物量无明显变化.此处环氧化物水解酶转化能力的提高,有可能是因为细胞体内该种酶含量增加,也有可能是金属离子使得酶的结构发生变化而导致其活性提高,还需进一步实验验证.

综合考虑生物量、转化率及剩余环氧化物的光学纯度,选择Zn2+进行下一步实验.

2.2.4 金属离子浓度的影响

在发酵培养基中分别加入1,2,3,4,5,6 mmol/L的Zn2+进行发酵,收集菌体后进行转化,测定生物量和转化率,结果如图4所示.

图4 Zn2+离子浓度对菌体生物量和转化率的影响Fig.4 Effect of Zn2+concentration on conversion yield and biomass

结果表明,对于该菌株,2 mmol/L的Zn2+对其生物量和转化率都有明显的促进作用,此条件下生物量最佳,虽转化率不是最高,但是剩余环氧化物的光学纯度最高.从图4可以看出,1～4 mmol/L的Zn2+浓度范围内,细胞的转化能力都有明显提高,而生物量从3 mmol/L开始呈下降趋势.5 mmo l/L开始,无论转化率还是生物量,都明显下降,这说明过高的Zn2+浓度已经对细胞产生毒害作用.

2.2.5 底物的诱导作用

在基础发酵培养基中分别加入体积分数为0.1%,0.2%,0.4%,0.6%,0.8%的EM PP,以不加EM PP为对照,进行发酵和菌体转化,测定转化率.结果表明,在发酵过程中加入底物,使菌体生物量明显降低,除含0.1%EM PP的培养基外,其余培养基中几乎无细胞生长,可能是环氧化物对细胞的毒害作用所致.含0.1%EM PP的发酵瓶中,生物量也降低,分析收集所得的菌体,其酶活也有下降.这说明该菌株对环氧化物较敏感,且该酶为非诱导酶.

3 结 论

以邻甲氧基苯基缩水甘油醚为唯一碳源,从土壤中筛选出一株具有立体选择性环氧化物水解酶的菌株,经鉴定该菌株为层出镰刀菌.之后对其产酶发酵条件进行了研究,最佳碳、氮源分别是2.0%蔗糖和2.0%黄豆粉,初始p H为4.0,且该酶不是诱导酶,2 mmol/L的Zn2+对其细胞生长和酶的诱导激活作用显著.最终,该发酵条件下获得的菌株整细胞对邻甲氧基苯基缩水甘油醚进行底物转化,转化率为59.2%,剩余R型环氧化物ee值为93.8%.

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Research on the Screen ing and Fermen tation Conditions of Botryosphaeria Dothidea with Enan tioselective Epoxide Hydrolase

SHENG Yan-min,ZHANG Zheng-fang,WANG Shan,ZHU Qing
(College of Biological and Environmental Engineering,Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014,China)

Considering glycidylmethoxyl phenyl ethers as the unique carbon source,the paper has screened the fungiof epoxide hydrolase w ith stereoselectivity from soil,and obtained Fusarium proliferatum ZJUZQ 010.After op timizing its fermentation conditions,the results show that the best carbon source is 2.0%sucrose,the best nitrogen source is 2.0% soybean meal,the initial p H is 4.0,and the epoxide hydrolase is not induced enzyme in this strain.2 mmol/L Fe2+is good fo r auxesis as well as the induction and activation of enzyme.When the fractional conversion is 59.2%,the ee value of rest (R)-enantiomer is 93.8%.

epoxide hydrolase;Fusarium proliferatum ZJUZQ010;glycidyl methoxyl phenyl ethers;fermentation; op timization

Q 939.97

A

1674-232X(2010)03-0215-05

DO I:10.3969/j.issn.1674-232X.2010.03.011

2010-03-17

钱江杰出人才计划(2006R10016);浙江省自然科学基金(Y2080303).

盛艳旻(1985—),女,浙江金华人,发酵工程专业硕士研究生,从事环氧化物水解酶用于手性拆分方面的研究.＊

朱 勍(1970—),男,浙江金华人,教授,从事化学生物学、生物转化的研究.E-mail:zhuq@zjut.edu.cn