结直肠癌组织中MAC30的表达及其临床意义

赵增仁，张丽静，张志勇，张学明，胡月明，李芳，孙晓峰

（1.河北医科大学 第一医院普外科，石家庄 050031；2.唐山市工人医院 病理科，河北 唐山 063000）

脑膜瘤相关蛋白（meningioma-associated protein，MAC30）首先发现在脑膜瘤中呈过度表达［1］，随后发现其在乳腺癌、胃癌和结直肠癌中表达也上调，但在胰腺癌中表达减少或缺失［2］。我们采用免疫组织化学法检测MAC30蛋白在结直肠癌组织、正常黏膜及转移淋巴结中的表达水平，同时检测结直肠癌及正常黏膜中MAC30mRNA的表达，分析其与结直肠癌临床病理特征间的关系，探讨MAC30在结直肠癌发生、发展及预后中的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

收集唐山市工人医院2007年1月至2008年12月的结直肠癌石蜡存档蜡块共130例，包括对应病例的正常黏膜组织73例，淋巴结转移癌组织34例。收集2007年10月至2009年1月50例来自河北医科大学第一医院、唐山市工人医院和河北医科大学第四医院结直肠癌手术标本。每例标本分别取自结直肠原发肿瘤组织、距肿瘤2 cm的无瘤黏膜组织、近端和远端切缘正常黏膜组织（直肠癌无远端切缘黏膜）。新鲜标本离体后迅速置于液氮中，于-80℃保存。所有患者术前未接受任何化疗和放疗。年龄31～90岁，平均57.6岁。其中男性31例，女性19例；≤60岁30例，>60岁20例；中高分化41例，低分化9例；无淋巴结转移27例，淋巴结转移23例。

1.2 主要试剂

鼠抗人MAC30单克隆抗体由孙晓峰教授馈赠，S-P免疫组化试剂盒（北京中山生物技术有限公司）、Trizol试剂（Invirotrogen）、cDNA第一链合成试剂盒（Fermentas）、TaqDNA 聚合酶（Promega）。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学染色及结果判定：采用S-P两步法，按试剂盒说明书进行操作。用0.01 mol/L PBS代替一抗作为阴性对照。MAC30染色阳性物质主要定位于细胞质，呈棕黄色颗粒。高倍镜下随机选取5个视野（每个视野观察细胞数不少于200个），按切片中细胞着色深浅评分：细胞无显色为-，浅黄色为+，棕黄色为++，棕褐色为+++。

1.3.2 结直肠癌组织MAC30mRNA表达测定：采用逆转录聚合酶链反应法（RT-PCR），按照试剂盒说明提取组织中的总RNA，将RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板，PCR扩增MAC30及β-actin基因片段。MAC30引物序列，上游：5′ACTGCTCAGAACCCACGTCT 3′，下游：5′ATCATGCCACTGCCCTTTAC 3′，扩增产物片段长度为 168 bp；β-actin 引物序列，上游：5′GGAAATCGTGCGTGACATTA 3′，下游：5′GGAGCAATGATCTTGATCTTC 3′，扩增产物片段长度为379 bp；引物由北京塞百盛生物有限公司合成。PCR 反应体系为：cDNA 2 μl，TaqDNA 聚合酶 0.125 μl，上下游引物各 10 pmol，10 mmol/L dNTPs 1 μl，补 DEPC 处理过的水至终体积 25 μl。反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环，最后72℃延伸7 min。取PCR反应产物5 μl置2%琼脂糖凝胶电泳、采用凝胶成像及图像分析软件对电泳条带进行分析。根据MAC30与β-actin条带灰度比半定量分析MAC30mRNA的表达水平。

1.4 统计学分析

选用SPSS 13.0统计软件对实验结果进行χ2检验、t检验、方差分析。MAC30表达和生存期之间的关系采用Cox回归模型。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MAC30在不同结直肠组织中的表达

MAC30在结肠正常黏膜组织中表达较弱，其表达强阳性率为11%（8/73）；结直肠癌组织及转移淋巴结中MAC30染色较强，130例结直肠癌组织中MAC30表达强阳性率为48%（62/130），转移淋巴结中为65%（22/34）；结直肠癌组织及转移淋巴结中MAC30的表达远远高于正常黏膜（P＜0.01）。见图1。

2.2 MAC30mRNA在不同结直肠组织中的表达

MAC30mRNA在结直肠癌组织的表达（0.57±0.36）较癌旁无瘤黏膜（0.35±0.25）、近端（0.34±0.25）及远端正常黏膜（0.35±0.28）的表达明显增强（P＜0.01）；癌旁无瘤黏膜、近端及远端正常黏膜中MAC30mRNA的表达无明显差别（P＞0.05）。见图2。

2.3 结直肠癌组织中MAC30mRNA的表达与临床病理特征的关系

在黏液癌/印戒细胞癌中MAC30mRNA的表达水平（0.80±0.40）较非粘液癌（0.48±0.29）明显增高（P＜0.01）。伴淋巴结转移者MAC30mRNA的表达水平较不伴有淋巴结转移者高，但差别无统计学意义。见表1。

2.4 MAC30mRNA的表达与结直肠癌患者生存期的关系

对结直肠癌患者术后生存期进行评估，以中位数为界，将其分为高表达和低表达两组。结直肠癌中MAC30mRNA高表达的患者3年生存率明显低于MAC30弱表达患者，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

3 讨论

MAC30位于染色体 17q11.2，1993年 Murphy等［1］发现该蛋白在脑膜瘤中高表达，因此而命名。2004年Kayed等首次发现MAC30在正常结肠、胃、食管及胰腺组织中均有表达。MAC30mRNA及蛋白在人多种肿瘤中表达水平不同，如：在胰腺癌和肾癌中低表达，在卵巢癌、食道癌、胃癌和结肠癌中高表达［2］。在一项前期研究中，我们发现直肠癌患者无论术前是否曾接受放疗，MAC30蛋白的表达均明显上调，并且在浸润性生长的肿瘤中其表达也增加［3］。本次试验发现，从远端正常结肠黏膜→原发癌组织→淋巴结转移灶，MAC30蛋白表达逐渐增强，在原发癌组织中表达显著高于正常黏膜。同时，MAC30mRNA在结直肠癌组织的表达较癌旁无瘤黏膜、近端及远端正常黏膜的表达明显增强，与MAC30蛋白表达一致，表明MAC30mRNA在结直肠癌的发生发展中起一定的促进作用。

表1 MAC30mRNA表达与结直肠癌临床病理特征的关系（±s）Tab.1 Relationship ofMAC30mRNA expression in primary tumor with clinicopathologic features（±s）

表1 MAC30mRNA表达与结直肠癌临床病理特征的关系（±s）Tab.1 Relationship ofMAC30mRNA expression in primary tumor with clinicopathologic features（±s）

Variables n MAC30mRNA expression tvalue P-value Histology -2.739 0.009 Non-mucinous 40 0.48±0.29 Mucinous/signet-ring cell 10 0.80±0.40 Differentiation 0.561 0.578 Better/moderate 41 0.55±0.35 Worse 9 0.47±0.26 Lymph nodes metastasis－0.616 0.541 No 27 0.48±0.24 Yes 23 0.52±0.26

另外，MAC30mRNA在结直肠癌组织中的表达上调与肿瘤的组织学类型密切相关，黏液/印戒细胞癌中MAC30mRNA的表达较非黏液性腺癌的表达水平明显增高，这可能解释了为什么MAC30的表达和患者预后有关。目前许多证据表明，结直肠黏液癌/印戒细胞癌病人预后较非黏液癌病人更差［4，5］，黏蛋白可能通过分泌唾液酸残渣遮蔽抗原表位而干扰肿瘤细胞的免疫识别和淋巴细胞的浸润。随后，我们对患者生存期进行研究，发现MAC30mRNA在结直肠癌中的表达水平和患者的3年生存期密切相关，MAC30mRNA高表达的患者3年生存率较低。这证实MAC30mRNA的表达上调和结直肠癌患者的预后不良有关，MAC30的高表达可作为评估患者临床预后的一项生物学指标。

MAC30的高表达和肿瘤的组织学类型及患者预后不良有关，提示MAC30在结直肠癌进程中发挥着重要作用，故我们推测MAC30可以作为肿瘤诊断、恶性进展及预后判断的有效指标，并可能为结直肠癌的基因治疗提供有效靶点。

［1］Murphy M，Pykett MJ，Harnish P，et al.Identification and characterization of genes differentially expressed in meningiomas ［J］.Cell Growth Differ，1993，4（9）：715-722.

［2］Kayed H，Kleeff J，Ding J，et al.Expression analysis of MAC30 in human pancreatic cancer and tumors of the gastrointestinal tract［J］.Histol Histopathol，2004，19（4）：1021-1031.

［3］Zhang ZY，Zhao ZR，Adell G，et al.Expression of MAC30 in rectal cancers with or without preoperative radiotherapy ［J］.Oncology，2006，71（3-4）：259-265.

［4］Catalano V，Loupakis F，Graziano F，et al.Mucinous histology predicts for poor response rate and overall survival of patients with colorectal cancer and treated with first-line oxaliplatin-and/or irinotecan-based chemotherapy［J］.Br J Cancer，2009，100（6）：881-887.

［5］Song W，Wu SJ，He YL，et al.Clinicopathologic features and survival of patients with colorectal mucinous，signet-ring cell or non-mucinous adenocarcinoma：experience at an institution in southern China［J］.Chin Med J，2009，122（13）：1486-1491.