杨先鸣,李 敏,张 汆,王金秀
(滁州学院 化学与生命科学系,安徽 滁州 239000)
毛细管电泳法定量测定发酵产物中的洛伐他汀
杨先鸣,李 敏,张 汆,王金秀
(滁州学院 化学与生命科学系,安徽 滁州 239000)
建立了发酵样品中洛伐他汀的毛细管电泳定量测定方法。以含12%乙醇(V/V)的50mmol/L甘氨酸(Gly)-NaOH为背景缓冲液,检测波长238 nm,操作电压28 KV,压力(5kPa)进样5 s,毛细管:48.5/40 cm×50 μm。在优化的条件下,线性范围4.0-80.0μg/mL(相关系数r=0.9997,n=8),加标回收率88.13%-101.29%,最低检出限为1.0μg/mL,定量检出限为3.3μg/mL,相对标准偏差1.32%-1.64%。该方法简便有效。可用于发酵品中洛伐他汀的定量检测。
毛细管电泳;洛伐他汀;发酵品;定量分析
洛伐他汀(Lovastatin,LVT)是从红曲酶中发现的一种强效降血胆固醇的活性物质[1]。目前,洛伐他汀主要是从红曲发酵品中获得,检测发酵品中LVT方法的研究对于控制发酵工艺条件非常重要。在实际生产中,由于发酵产物中的组份较复杂,洛伐他汀含量低,且在发酵的过程中含量有一定变化,所以要求建立一种分析速度快、灵敏度高的分析方法。目前报道的测定LVT的方法主要有高效液相色谱[2,3]和紫外分光光度法[4]。但少见利用毛细管电泳来检测发酵品中的洛伐他汀。与液相色谱分析法相比,高效毛细管电泳(CE)具有高效、快速、低耗、超微量进样、污染少、适合大批量自动分析等优点,已在分析科学领越得到较广泛的应用。本文采用常用试剂利用简单方法提取发酵品中的LVT,直接上样分离检测LVT,通过在背景缓冲溶液中添加适量乙醇,在5min内可同时完成LVT的分离和测定。
Agilent CE G1600A;DAD检测器色谱工作站;熔融石英毛细管 (50μm48.5/40.0cm)(美国 Agilent公司)。Milli-Q超纯水(美国Millipore公司);PHS-3C数显型酸度计 (上海宇隆仪器有限公司);KQ2200B型超声波仪(昆山市超声仪器有限公司);水相微孔滤膜0.45μm;洛伐他汀(≥99.1%)、发酵品,由浙江海正股份有限公司提供;甘氨酸(上海源聚生物科技有限公司),无水乙醇(无锡市亚盛化工有限公司),氢氧化钠(广东汕东西陇化工厂),试剂均为分析纯。
精确称取样品100mg用1000μL含50%(V/V)乙醇的Gly-NaOH缓冲溶液 (50mmol/L,pH=10.5)提取发酵样品:超声波振荡 (40℃,20 min)。5000 rpm/min离心5 min,然后取上清100μL,加400μL上述Gly-NaOH缓冲溶液摇匀后上机检测。
准确称取洛伐他汀标准品10.0mg,用含50%(V/V)乙醇的Gly-NaOH缓冲溶液(pH=10.5)溶解并定容至10.00mL,制得浓度为1.0mg/mL的储备液。分别移取储备液20,40,80,160,240,320,400 μL,加到100mg样品空白中,加入含乙醇的Gly-NaOH缓冲溶液(pH=10.5)至1000μL(最终溶液含50%乙醇),按1.2操作,取100μL上述标准溶液加400μl背景缓冲溶液,混匀后上机检测。
称取甘氨酸(Gly)配制成100mmol/L,稀释至浓度为30-90mmol.L-1的缓冲溶液。用NaOH溶液调至pH为9.0-11.0,最终确定的背景缓冲溶液为12%乙醇的50mmol/L Gly-NaOH(pH=10.5),用微孔滤膜过滤后使用。
毛细管温度控制在20°C.运行电压28kV,50kPa压力进样5s。阴极端DAD检测,检测波长238nm。进样前,毛细管依次用超纯水、NaOH、超纯水和背景缓冲液压力冲洗 10min、20 min、5 min和 10 min.两次进样中间用缓冲液冲洗2min。
Lovastatin是一种白色针状晶体,易溶于甲醇、乙醇等有机试剂和碱性溶液,在水溶液中,Lovastatin具有酸式与内酯型两种形式,见图1,在pH>7.7时,内酯环开环呈酸式结构;在pH3.0时呈内酯形式[3],当用无水乙醇提取,取上清加缓冲液后,测试电泳图杂峰较少,但目标峰和乙醇峰重合,只有很小的负离子峰,说明LVT主要以不带电的内酯型存在,随着放置时间的增加,峰高逐渐增高,需要一定时间才能稳定。因此考虑样品的性质和电泳分析方法的要求,采用V(乙醇):V(缓冲溶液pH=10.5)=1:1的混合溶液提取LVT,使LVT全部转化为酸式结构。实验表明,放置3天,峰高没有明显变化,这种提取方法简单易行。
图1 lovastatin的酸式和内酯式结构式
2.2.1缓冲溶液对分离的影响 试验了磷酸、硼砂、甘氨酸与NaOH配制成的缓冲溶液作为背景电解质,实验表明,在相同浓度和相同pH条件下,三种缓冲溶液对分离的效果没有显著差别,且Gly-NaOH的电流最小,因此选择Gly-NaOH进行浓度和pH做条件优化实验。由于LVT酸的pKa在9左右[5],考虑到LVT的离解度,选取pH9.0-11.00范围进行优化。 实验表明, 当固定缓冲液浓度80mmol/L,随着pH的增大,峰高略增加,pH〉10.50时,峰高不变,但不能得到基线分离。故在pH=10.50的条件下,考察浓度30-90mmol/L的目标峰分离情况,发现随着浓度的增大,迁移时间变长,峰高无明显变化,但仍不能得到基线分离。故采用在50mmol/L,pH=10.50的Gly-NaOH背景缓冲溶液中加入有机添加剂进行分离条件优化实验。
2.2.2有机添加剂乙醇浓度的影响 选择毒性较小的乙醇作为缓冲溶液添加剂。乙醇浓度(V/V)选择6—18%,考察其对分离度和出峰时间的影响。随着乙醇浓度的提高,目标峰与杂质分离的分离效果越好,达到12%时,可以基线分离。但乙醇浓度的增加使峰高有所下降且峰宽增大,迁移时间变长(见图2)。考虑分离效果和实验时间,选择乙醇浓度为12%,在5min内达到基线分离(见图3)。
图2缓冲溶液中乙醇浓度的影响
图3加入乙醇对分离效果的影响
2.2.3电压的影响 在上述优化条件下,改变电压20-30kV,考察分离情况。实验表明,在所试电压条件下,均可得到基线分离;比较逢高和出峰时间,随着电压的增大,逢高略有增加,出峰时间缩短,考虑时间因素,选择了稍低于仪器极限电压的次高值28kV为操作电压。
2.3.1专一性 为了检验方法的专一性,在优化条件下,分别作了样品空白、实际样品的电泳图,并在样品中加入标准溶液,对照三条电泳曲线,确定LVT在4-5min出峰,由图4可知目标峰能很好的分离。
图4 空白、样品及加标电泳图
2.3.2工作曲线 按1.3方法,制得一系列标准溶液,浓度分别为 4、8、16、32、48、64、80μg/mL,在优化电泳条件下,测LVT峰高,以浓度为横坐标,峰高为纵坐标,绘制工作曲线。线性方程为y=0.203+ 0.130x,R=0.9997。方法的线性范围为4-80μg/mL,按信噪比3:1,计算最低检测限 (LOD)为1.0μg/ mL;10倍信噪比的定量检测限为3.3μg/mL.
2.3.3方法精密度 选取适量标准储备溶液按1.3处理,得到浓度为4、32、80 μg/mL的溶液,在优化条件下分别测定6次,计算标准差和相对标准差。结果表明,相对标准差在1.32-1.64%,说明新方法的精密度较好。
2.3.4方法的准确性 为了验证方法的可靠性,采用在已知含量样品中加入浓度为8,16,24μg/mL的标准品,在优化条件下检测LVT含量(n=3)。 计算回收率。结果表明回收率在88.13-101.29%,在可接受范围。说明新方法是可靠的。如表1所示。在优化条件下,检测了4种不同LVT含量的发酵品,结果如表2。
表1 LVT的加标回收率实验结果(n=3)
表2 4种发酵品中LVT的测定结果(n=3)
以一定体积比的乙醇和缓冲溶液的混合液作为电泳背景电解质,建立了一种毛细管区带电泳定量测定发酵品中的LVT的方法。结果表明,此方法简单,有效。采用常见简单试剂,消耗少,避免使用有毒的有机试剂,符合环境保护的理念。方法的检出限、回收率、精密度,相关系数均达到要求,适用于生产过程中LVT的检测。
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[2]Fruedrich J,Zuzek M.,Bencina M,et.al.High-Performance liquid chromatographic analysis of mecinolin as mevinolinic acid in fermentation broths[J].J.Chromatogr A.1995,704:363-367.
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[4]文镜,顾晓玲,常平,等.双波长紫外分光光度法测定红曲中洛伐他汀的含量[J].中国食品添加剂,2000(4):11-17.
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[责任编辑:钱立武]
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1674-1102(2010)03-0022-03
2010-03-23
安徽省应用化学省级重点学科建设项目(200802187C);滁州学院科研项目(2008kj018B)。
杨先鸣(1957-),男,山东牟平人,滁州学院化学与生命科学系实验师,研究方向为生物分离与分析。