盐碱土中可培养中度嗜盐菌的研究

王 爽 ，杨 谦＊ ，孙 磊 ，王 允，Olivia Juba

（1.哈尔滨工业大学生命科学与工程系，哈尔滨 150001；2.黑龙江省农业科学院土壤肥料与环境资源研究所，哈尔滨 150086）

中度嗜盐菌是一类能够适应盐浓度在3%～15%NaCl之间有最佳生长能力的极端微生物类群[1]。中度嗜盐菌分布极其广泛，在盐湖、盐碱湖、海洋、晒盐池、盐碱土壤以及海产品和一些盐渍类食品中均有发现[2]。最早关于中度嗜盐菌的研究是LeFever和Round对黄瓜发酵盐水进行微生物学研究时[3]，在0～15%NaCl浓度范围内分离得到了一群无色细菌。第一个有效命名的中度嗜盐菌是Vibrio costicola[4]。随着中度嗜盐菌分类工作的进展，许多相关的种被归入相应的科和属。中度嗜盐菌自身拥有在高盐环境生存的适应机制，也因其盐耐受范围宽，而能够在盐湖、盐性土、沙漠、盐矿、盐田、盐渍食物等多种不同的高盐环境中生存。

我国北方存在大面积的盐碱地，蕴藏着丰富的嗜盐微生物资源，为开展嗜盐菌的研究提供了得天独厚的条件。试验采集大庆市盐碱地的20个盐碱土样，对其进行嗜盐菌的分离、生物学特性的分析及系统发育地位的确定，从中筛选出潜在的新种。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

2007年4月3日，于大庆市开发区公路附近、一营附近和黑龙江八一农垦大学附近采集盐碱土20份装于无菌塑料袋中，密封，带回实验室于4℃保存。

1.2 菌株的分离及筛选

采用稀释平板法将不同稀释度的土壤混合样品分别涂布于10%、15%和20%NaCl的改良S-G固体培养基上[5]，37℃培养3 d，挑取不同类型的单菌落反复划线，直至获得纯种，保存备用。

1.3 形态观察

将获得的45株细菌接种于改良的S-G固体培养基，37℃培养3 d，记录菌落颜色及形态，同时进行革兰氏染色，在油镜（10×100）（OLYMPUS BX5-1）下观察菌体形态。

1.4 生理生化特征测试

生理生化特征参照文献[6]的方法，选择了氧化酶、过氧化氢酶活性，产H2S，Tween、淀粉、明胶和酪素的水解试验。

1.5 16Sr DNA基因序列扩增和系统进化分析

选择有代表性的菌株进行16SrDNA基因序列扩增和系统进化分析。

1.5.1 菌体总DNA的提取

将菌株接种于改良的S-G液体培养基中，在37℃振荡培养至对数生长期，以6 000 r·min-1离心收集菌体。细菌总DNA的提取采用传统方法[7]。

1.5.2 16SrDNA的PCR扩增

以细菌总DNA为模板进行PCR扩增，正向引物Primer1（对应于E.coli的16S rDNA 5'端8～27f位置）：5'AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 3'；反向引物Primer2（对应于E.coli的16SrDNA 5'端1 522～1 541位置）：5'AAGGAGGTGATCCAGCCGCA 3'。PCR扩增条件：94℃预变性5 min，加Taq酶后94℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min 40 s，共30个循环，最后再72℃延伸7 min。

1.5.3 PCR产物的连接与转化

用北京宝泰克生物技术有限公司的多功能DNA纯化回收试剂盒回收纯化PCR产物。回收的PCR产物与pMD18-T载体在16℃连接10 h，热冲击法转化E.coli Top10感受态，37℃振荡培养1 h后，涂在含有氨苄青霉素的LB平板上，于37℃过夜培养，从平板上挑取菌落进行菌液PCR（反应条件与1.5.2相同）以筛选出阳性克隆。

1.5.4 16SrDNA序列分析及系统进化树的构建

阳性转化子制成菌液送上海Invitrogen生物技术有限公司测序。将测得的序列利用Blast软件在GenBank、EMBL及DDBJ等数据库中进行相似性搜索，选取同源性较高的典型菌株的16SrDNA序列作为参比对象，然后用CLUSTAL W软件进行多序列比对并计算供试菌株与参比菌株之间的序列相似性[8]，使用MEGA 3.1软件包中的Kimura 2-Parameter Distance模型和Neighbor-Joining法构建系统进化树[9]，1 000次随机抽样，计算Bootstrap值以评估系统进化树的置信度。

2 结果与分析

2.1 形态学特征

混合土样经富集后，分别接种于含有10%、15%和20%NaCl的改良S-G固体培养基上光照培养，所获得的大量菌落中其中40%为黄色，其余为乳白色；在乳白色菌落中，边缘呈锯齿状且难挑取的菌落约占26%，其他均为光滑、边缘整齐且易挑取的菌落。经初筛后获得45株分离株，G+与G-菌的比例为19：26（分别以枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌作为阳性和阴性对照）。根据菌落特征、细胞形态和革兰氏染色反应的差异选择其中的8株作为研究对象，菌株编号分别为X10-1，X10-2，X10-7，X1006，15-1，15-2，15-7和20-9，其细胞形态及培养特征见图版Ⅰ和表1。8株中度嗜盐菌全部为杆状，菌株15-7的菌体较小，（0.5～0.7）μm×（1.4～1.6）μm，另7株大小为（0.6～0.8）μm×（3.8～4.2）μm。

图版I 8株中度嗜盐菌的显微照片（标尺=5.0μm）Plate I Micrographs of eight strains moderately halophiles(Scale bar=5.0μm)

2.2 生理生化特征

部分生理生化试验结果见表2。菌株X10-1与X10-7仅Tween20的水解能力不同，其他各项指标的结果均一致，这表明两菌株在系统分类上亲缘关系可能较相近；菌株X1006和15-1各生化指标的结果完全相同，而与20-9的大部分结果一致，只是它们分别为10%、15%和20%NaCl改良S-G培养基中的优势菌群，说明这三株菌在系统分类上亲缘关系也比较相近，可能X1006与15-1即为不同培养基上获得的同一菌株。

2.3 分离株16Sr DNA序列比较及系统发育分析

8株中度嗜盐菌进行16S rDNA全序列测定，获得几乎全长的16SrDNA序列（1 500 bp以上）。采用Neighbor-Joining法构建系统进化树，属于Bacillaceae科的6株菌株的16SrDNA序列进化树如图1（A）所示，属于Halomonadaceae科的2株菌株的16SrDNA序列进化树如图1（B）所示，节点的数字表示经过1 000次Bootstrap分析得到的结果，标尺表示每100个核苷酸中有1个碱基替换。

采用Blast软件将测得的序列与GenBank数据库中的已知序列进行同源性比较和系统发育分析，菌株15-1、20-9和X1006与Bacillaceae科的Alkalibacillus属处于同一分支上，并与亲缘关系最近的成员Alkalibacillus haloalkaliphilus DSM 5271T相似性超过99%，因此，它们应为同一物种。菌株X10-1、X10-7和15-2与Bacillaceae科的Bacillus属处于同一分支上，其中15-2与Bacillus agaradhaerens DSM 8721T的16S rDNA序列相似性为99.6%，它们应为同一物种；X10-1和X10-7的16SrDNA序列与Bacillus saliphilus DSM 15402T的相似性最高，达到97.8%，与Bacillus属的其他成员相似性低于97%，而菌株X10-1和X10-7之间16SrDNA序列的的差异仅为0.13%，结合两菌株表型特征和生理生化特征的数据，因此它们可能代表Bacillus属的同一新种。菌株15-7和X10-2聚在Halomonadaceae科的Halomonas属，它们与Halomonas pantelleriensis DSM9661T的序列相似性最高，分别为98.8%和98.7%，而与Halomonas属的其他成员的相似性≤96%，它们可能为Halomonas属下的新种；菌株15-7和X10-2之间16SrDNA序列的差异为0.58%，部分生化特征结果明显不同，因此，两菌株彼此之间的差异及与Halomonas pantelleriensis DSM9661T的亲缘关系有待于通过更详细的表型特征和DNA-DNA杂交试验的进一步确定。

表1 细菌的形态及培养特征Table 1 Morphology and cultural characteristics of isolates

表2 8株中度嗜盐菌的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of eight strains moderately halophiles

图1 中度嗜盐菌基于16Sr DNA序列的系统进化树（A）和（B）Fig.1 Phylogenetic tree(A)and(B)base on the 16Sr DNA sequence of moderately halophilic bacteria

3 讨论

中度嗜盐菌对环境有极强的适应能力，在自然界中广泛分布，是盐生生态系统重要的组成之一。近年来，我国的科研人员几乎每年都从国内的不同盐环境中分离出许多新的嗜盐微生物类群并得到了国际学术界的承认。吴晓磊等在研究微生物有效降解石油污染物的过程中，从大庆油田的原油污染盐土中分离到一株新的中度嗜盐菌，并将其命名为Halomonas daqingensis sp.nov.[11]，除此之外，还没有来自该地区的其他嗜盐菌新分类群的相关报导。因此，调查该地区嗜盐微生物的多样性，并尽可能多的分离、获得和保藏菌株，可为大庆盐碱地微生态学的研究奠定基础，也将为嗜盐菌的应用研究提供材料来源和信息。

使用分子生物学方法研究微生物在环境中的多样性已在多种极端环境中展开，这些方法基本上都是利用PCR扩增来获得环境中微生物区系的16S rDNA的信息，然后进行系统分类学研究[10]。本研究测定的嗜盐菌16SrDNA序列在GenBank数据库中的比对结果表明，大庆盐碱土中蕴藏着丰富的嗜盐微生物资源，目前所获得的中度嗜盐菌菌株分布在Alkalibacillus、Bacillus和Halomonas三个属，可能由于采用的分离培养基较单一，大大限制了可培养微生物的种类。在今后的研究工作中可尝试采用不同的培养基进行分离筛选，并结合详细的表型特征、化学分类特征以及与模式种的分子杂交等数据的分析来确定分离株的分类地位。

4 结论

本文采用传统的微生物分离纯化技术、显微观察、生理生化特性分析与分子生物学相结合的方法对大庆盐碱土中的中度嗜盐细菌进行分类学研究。在所分析的8株中度嗜盐菌菌株中，菌株X1006、15-1和20-9属于Alkalibacillus属，且与已知种具有较高的同源性；菌株X10-1、X10-7和15-2属于Bacillus属，其中X10-1（或X10-7）可能为一新种；而菌株X10-2和15-7为Halomonas属的成员，与已知种Halomonas pantelleriensis DSM9661T的16SrDNA相似性可将分离株考虑为Halomonas属的新种。各菌株分类学地位的最终确定将在今后的研究工作中完成。

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