韭葱黄条病毒黑龙江分离物外壳蛋白基因克隆与序列分析

张 威，白艳菊*，张匀华，申 宇，高艳玲，耿宏伟，范国权，孟宪欣

（1.黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所，哈尔滨 150086；2.黑龙江省农业科学院植物保护研究所，哈尔滨 150086；3.黑龙江省农业科学院作物育种研究所，哈尔滨 150086）

韭葱黄条病毒（Leek yellow stripe virus，LYSV）是马铃薯Y病毒属Potyvirus的典型成员，病毒粒子为弯曲线状，无包膜，长度为680～900 nm，直径11～12 nm，是侵染大蒜的主要病毒。LYSV是单链正义RNA病毒，基因组全长10 142 bp，5′端具有病毒基因组结合蛋白VPg，3′端具有Poly（A），基因组含一个开放阅读框（ORF），翻译成一个具有蛋白酶功能的多聚蛋白，再自身酶解成包括外壳蛋白在内的10个多肽[1-2]。LYSV由蚜虫以非持久方式传播，广泛分布于世界各大蒜种植区[3]，严重影响大蒜的产量和品质。

黑龙江省发展大蒜产业具有得天独厚的地理、气候优势，在哈尔滨市阿城区、宁安市、富锦县、讷河县、绥陵县等地均大面积种植大蒜，是我国大蒜重要产区之一。由于大蒜为无性繁殖作物[4-6]，随着种植年限的增加病毒病危害愈加严重，给黑龙江省大蒜产业的发展造成了严重影响。因此，建立快速、准确的分子检测技术对于研究LYSV发生、分布与危害具有科学意义和实用价值。国外应用RTPCR方法进行大蒜病毒检测较多，Takaki等从大蒜花叶病毒病叶上分离了LYSV的弱毒株系和强毒株系，克隆了基因组全序列，并比较其序列之间的差异[7]。目前，国内仅限于有关RT-PCR技术检测大蒜病毒的报道[2,8]，但缺乏对病毒基因序列的分析。

本研究利用病毒特异性引物扩增了LYSV黑龙江分析物的CP基因，并与其他LYSV分离物进行了同源性比较和系统进化树分析，从基因水平上明确不同病原小种的进化关系，为LYSV黑龙江分离物的分子鉴定及其同种病毒不同分离物的遗传进化研究提供了理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

大蒜病株采自黑龙江省哈尔滨市阿城区、宁安市、富锦县、讷河县等大蒜主产区，经电镜观察含有线状病毒粒子。将应用Agdia公司生产的DASELISA病毒检测试剂盒检测为阳性的样品，接种到LYSV的繁殖寄主韭葱上，置于温室中观察发病情况，经DAS-ELISA法检测病毒达到高峰期时采收，-80℃保存备用。LYSV的阴、阳性对照由黑龙江省农业科学院植物脱毒苗木研究所提供。

大肠杆菌Escherichia coli GM109，由东北农业大学提供。pMD18-T（购自TaKaRa（大连）公司）；M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂、TaqDNA聚合酶、Eco RⅠ和SalⅠ（购自宝生物工程（大连）有限公司）；dNTP（购自北京鼎国生物技术有限公司）；B型质粒小样快速提取试剂盒和B型小量DNA片段快速回收试剂盒（购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司）；引物合成及序列测定委托上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 LYSV CP基因的克隆及序列测定

1.2.1 LYSV特异性引物的设计

根据GenBank中已报道的LYSV核苷酸序列，应用引物设计软件Primer Premier 5.0设计合成1对扩增LYSV CP基因全序列引物，其序列为：上游引物 LY-CP1：5'CCGAATTCATGTTTGAGTATCA AGCCGG 3'，下游引物LY-CP2：5'CCGTCGACTC ACTGCATATGCGCACCAT 3'。在上游引物中引入Eco RⅠ酶切位点，下游引物中引入SalⅠ酶切位点。

1.2.2 病毒总RNA的提取

参考侯义龙等的方法提取总RNA[9]，并稍有改动。取50 mg感病组织于1.5 mL Eppendorf管中，液氮中研磨，加入600 μL提取缓冲液（50 mmol·L-1pH 8.0 的 TrisCl、140 mmol·L-1NaCl、10 mmol·L-1EDTA、1%SDS、2%PVP、10 U RNAsin、2%巯基乙醇，后两种现用现加），离心去渣取上清。加入与上清液等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）溶液，混匀，离心取上清。加入与上清液等体积的氯仿∶异戊醇（24：1）溶液，混匀，离心取上清；加入上清液2.5倍体积的无水乙醇和1/10体积的3 mol·L-1的NaAc，混匀，-20℃放置3 h后，离心，弃上清，沉淀用70%乙醇洗2次。再用无水乙醇洗1次，真空干燥，溶于40 μL TE中，-20℃保存备用。

1.2.3 RT-PCR扩增

病毒RNA反转录体系：1.1 mmol·L-1dNTP、2.5 μL 5×Buffer、9.5 U RNasin、45.0 U RTase、2 μL 总 RNA、1.5 μmol·L-1引物，总体积为 10 μL。反转录程序：42℃1 h，95℃ 5 min，4℃5 min。RT-PCR反应体系：加入DNA模板4.0 μL、上下游引物各 22.0 ng、2.3 mmol·L-1MgCl2、0.2 mmol·L-1dNTP、1.0 U TaqDNA 聚合酶、2.3 μL 10×Buffer，总体积为25 μL。PCR反应程序：94℃5 min，94℃1 min，55℃1 min，72℃1 min，30个循环，72℃延伸10 min。PCR产物采用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，并用UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收目的DNA片段。

1.2.4 目的基因的克隆、序列测定与分析

PCR扩增产物纯化后连接到pMD18-T载体上，CaCl2法转化JM109大肠杆菌感受态细胞[10]。挑取抗性单菌落，扩繁后，应用B型质粒小样快速提取试剂盒提取质粒，利用Eco RⅠ和SalⅠ对重组质粒进行酶切鉴定。目的片段委托上海生工生物工程有限公司进行测定，采用DNAman和DNAstar软件进行序列分析。

2 结果与分析

2.1 LYSV CP基因的RT-PCR扩增

以感染LYSV的大蒜叶片总RNA为模板，利用LYSV病毒特异性引物LY-CP1和LY-CP2进行反转录和PCR扩增，得到一条特异片段，长度约为885 bp（见图1），而阴性对照无此特异条带。

图1 LYSV的RT-PCR扩增结果Fig.1 Amplification result of LYSV by RT-PCR

2.2 LYSV CP基因克隆

为了进一步验证所扩增的目的片段，将其克隆到pMD18-T载体后，提取质粒，并进行酶切鉴定。酶切产物的电泳结果显示（见图2），重组质粒利用Eco RⅠ和SalⅠ双酶切，可获得一条大小约885 bp的条带，与预期的大小相同，表明外源片段已插入到载体中。

图2 重组质粒的双酶切鉴定Fig.2 Digestion identification of recombined plasmids of LYSV by Eco R I and Sal I

2.3 LYSV CP基因的序列测定与分析

对重组质粒的插入片段进行序列测定，测序结果经DNAstar软件分析，只含有一个开放阅读框（Open reading frame，ORF），其长度为 885 bp，可编码295个氨基酸，其中A：295个、C：174个、G：225个、T：191个，G+C含量45.1%。将测得的序列与GenBank中查找来自不同国家和地区的其他LYSV分离物CP基因序列进行比较，结果表明，核苷酸序列同源性最高达88.6%，氨基酸序列同源性最高可达93.1%，证明成功扩增到LYSV黑龙江分离物HLJ的CP基因。GenBank登录号为GU373816。

2.4 LYSV不同分离物CP核苷酸及氨基酸序列差异分析

将LYSV 24个不同分离物的CP核苷酸序列进行同源性比较（见表1），结果表明，测得的LYSV黑龙江分离物HLJ与已知其他不同分离物的CP核苷酸序列同源性为79.7%～88.6%，而24个不同分离物间CP核苷酸序列的同源性为75.1%～100%。根据CP核苷酸序列推导对应的氨基酸序列，对LYSV的24个不同分离物CP基因的氨基酸序列进行同源性比较分析，结果表明，测得的LYSV黑龙江分离物HLJ与已知其他不同分离物CP氨基酸序列同源性为83.7%～93.1%，而24个不同分离物间CP氨基酸序列的同源性为75.8%～100%（见表2）。依据LYSV CP氨基酸序列建立系统进化树，可将LYSV不同分离物划分为4个类群：LYSV黑龙江分离物HLJ属于类群ⅳ，与南韩和巴西大蒜上的LYSV有较近的亲缘关系，表现一定的寄主相关性（见图3）。

图3 24个LYSV分离物CP基因氨基酸序列遗传进化Fig.3 Phylogenetic tree of coat protein amino acid sequence of 24 LYSV isolates

表1 24个参与序列比对的LYSV分离物来源Table 1 Origin of 24 LYSV isolates for sequences comparison

表2 2 4个LY SV 分离物CP 氨基酸序列比对结果T ab le 2 C om p a rison of co at p ro tein a m in o a cid seq u en ce o f 2 4 L Y S V iso lates 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 1 3 14 15 1 6 17 18 1 9 2 0 21 2 2 2 3 24 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24注13.3 12.1 10.9 17.6 16.3 15.8 17.1 15.6 14.7 17.1 13.7 6.9 16.6 16.4 10.9 14.1 15.9 18.5 10.4 8.4 10.9 11.2 11上.0方8 7.5 1 2.1 2 2.7 1 6.7 1 9.3 1 8.8 1 9.3 1 8.6 1 6.0 2 0.2 0.3 1 6.6 2 0.6 2 0.0 9.6 1.4 1 5.8 2 0.7 9.5 1 0.3 8.4 9.8 1 1.4列8 9.2 8 8.5 1 9.2 1 5.8 1 9.8 1 8.9 2 0.3 1 5.2 1 1.4 2 1.2 1 2.5 1 5.0 2 0.3 1 4.7 3.9 1 2.5 1 5.4 2 0.3 7.5 9.8 3.1 3.9 7.4，89.8 80.5 84.4 20.7 24.8 23.7 25.4 24.1 22.5 26.5 23.2 4.0 23.7 23.0 18.2 23.2 22.8 25.4 17.4 14.8 19.3 18.2 20.3 8 3.7 8 5.1 8 5.8 8 1.6 1 9.3 2 0.7 2 1.2 2 1.4 1 8.7 2 0.3 1 7.1 1 7.6 2 3.0 2 1.0 1 4.5 1 8.0 1 0.4 2 1.3 1 6.2 1 2.8 1 4.5 1 4.8 1 5.3变8 5.1 8 3.0 8 2.3 7 8.9 8 2.6 1 1.2 1 1.6 1 7.3 2 0.0 2.1 1 9.7 1 8.8 1 2.0 1 7.7 1 9.2 1 9.3 1 9.3 5.4 1 6.6 8.4 1 9.2 1 9.6 1 9.7。85.8 83.4 83.0 79.7 81.6 89.6 1.8 16.0 18.6 10.8 18.4 17.9 5.8 16.0 17.3 19.3 20.7 12.5 16.2 6.6 16.8 17.7 19.2 84.4 83.0 81.9 78.5 81.3 89.3 98.3 16.4 19.1 11.2 18.8 19.3 5.4 16.4 18.3 19.7 21.6 12.9 17.1 7.5 17.8 18.7 20.6 8 5.7 8 3.6 8 5.3 7 9.3 8 0.8 8 4.6 8 5.3 8 5.3 4.7 1 7.7 1 9.1 1 8.6 1 6.4 3.6 1 5.2 1 9.1 2 1.0 1 8.2 1 6.4 2.6 1 5.2 1 5.5 1 4.5 86.4 85.7 88.5 80.5 82.9 82.5 83.2 83.2 95.5 20.4 16.4 17.7 19.1 6.2 12.0 16.4 18.2 21.0 13.1 5.2 11.1 12.2 11.5 84.4 82.4 81.3 77.7 81.9 97.9 90.0 89.6 83.9 82.2 20.6 20.2 11.6 18.2 19.7 21.1 21.2 5.4 17.6 8.9 19.7 20.1 20.6 8 7.2 9 9.7 8 7.8 8 0.1 8 4.4 8 2.7 8 3.7 8 3.4 8 3.2 8 5.3 8 2.0 1 7.1 2 0.2 2 0.4 1 0.1 1.8 1 6.3 2 1.2 9.9 1 0.8 8.8 1 0.3 1 1.8 93.1 85.1 87.5 96.1 84.0 83.4 84.1 83.0 83.6 84.3 82.4 84.8 19.6 17.6 14.1 17.1 18.9 19.8 13.0 9.8 14.5 14.3 15.2 84.8 82.0 81.9 79.7 79.9 88.9 94.5 94.8 85.3 83.2 89.3 82.4 82.4 17.2 17.8 21.1 22.1 12.9 17.1 8.4 17.3 17.7 18.7 8 4.7 8 2.2 8 5.4 8 0.1 8 0.8 8 4.0 8 5.0 8 5.0 9 6.5 9 4.1 8 3.6 8 1.9 8 4.3 8 4.3 1 5.2 2 0.4 2 1.4 1 8.2 1 6.4 2.1 1 5.2 1 5.5 1 5.8 90.6 90.6 96.2 75.8 86.8 83.1 84.6 83.8 82.7 85.3 82.7 90.2 87.6 84.2 85.0 10.9 14.5 18.7 8.4 10.8 4.7 0.0 7.1 86.9 98.6 88.2 80.1 83.7 83.0 83.0 82.7 82.9 85.0 81.7 98.3 84.8 81.7 81.5 89.5 16.3 20.7 9.5 11.3 9.6 11.2 12.7 8 5.1 8 5.8 8 6.1 8 0.1 9 0.3 8 3.0 8 1.9 8 1.3 8 1.5 8 3.6 8 1.3 8 5.4 8 3.0 8 0.9 8 0.8 8 6.8 8 5.4 2 0.8 1 5.3 1 3.3 1 4.4 1 4.8 1 5.3 83.7 81.9 82.3 78.5 81.3 94.8 88.5 88.2 83.6 81.5 94.8 81.6 82.6 88.2 82.9 83.8 81.9 80.9 16.6 9.4 19.2 19.1 22.0 90.3 91.1 92.6 78.9 85.1 85.1 85.5 84.8 82.2 84.8 84.4 90.7 88.1 84.8 82.2 92.1 91.1 85.5 85.5 10.3 8.8 8.5 9.1 9 2.1 9 0.4 9 0.8 7 5.7 8 8.3 9 2.1 9 3.7 9 2.9 9 7.5 9 5.0 9 1.6 9 0.0 9 0.8 9 2.1 9 7.9 9 0.0 8 9.5 8 7.9 9 1.2 9 0.4 1 0.8 1 1.1 9.4 91.0 91.4 97.0 78.1 86.8 83.1 85.0 84.2 82.3 85.7 82.7 91.0 88.0 84.6 84.6 95.5 90.6 87.2 83.5 92.1 90.0 4.8 6.7 90.4 90.4 96.2 75.8 86.6 82.8 84.3 83.5 82.4 85.1 82.4 90.0 87.4 84.3 84.7 1 00 89.7 86.6 83.5 92.0 87.9 95.4 7.2 8 9.8 8 9.4 9 2.3 8 1.6 8 5.9 8 2.7 8 3.1 8 2.0 8 5.9 8 8.4 8 2.0 8 9.1 8 6.3 8 3.5 8 4.9 9 2.9 8 8.4 8 5.6 8 1.0 9 1.4 9 1.2 9 3.2 9 2.7：右为序同源性左下方为序列异度N ote∶T h e aboveright part p resen ts sequ en ce sim ilarity,and low -left part presen ts sequ en ce diversity.

3 讨论与结论

目前侵染大蒜的病毒主要有LYSV、大蒜普通潜隐病毒（Garlic common latent virus，GCLV）、洋葱黄矮病毒（Onion yellow dwarf virus，OYDV）和青葱潜隐病毒（Scallion latent virus，SLV）等，它们往往都是复合侵染大蒜，具有相似的特征，试验寄主范围较重叠，并且在感病寄主上表现相似的症状，所以，很难通过生物学方法对大蒜病毒进行分离与鉴定。

此外，大蒜病毒的传播途径、体外保毒期、稀释限点、钝化温度、细胞质内含体形态等生物学指标也可作为病毒鉴定标准[11]，但这些方法耗时长，且鉴定有效性差。目前，血清学方法仍是鉴定大蒜病毒的常用方法，但已有研究表明，利用血清学技术进行病毒小种的鉴定时结果不可靠，同一属内不同病毒间CP基因氨基酸序列同源性较高，抗血清常常会产生交叉反应，从而造成假阳性的出现，不能将这些病毒有效的区分开。

病毒的CP基因在寄主症状表现、寄主范围、病毒的介体传播等方面起着重要作用[12-13]。利用分子生物学方法鉴定植物病毒，可以通过病毒基因组结构和序列分析真实地阐明植物病毒种的分类[14-15]，明确了不同病毒小种的进化关系。

本研究克隆了LYSV黑龙江分离物（LYSVHLJ）的CP基因全长cDNA序列，序列分析表明，LYSV-HLJ与GenBank中其他不同分离物的CP核苷酸序列同源性为79.7%～88.6%，氨基酸序列同源性为83.7%～93.1%。可见，LYSV黑龙江分离物的序列变异较大。依据LYSV CP氨基酸序列建立系统进化树，可将LYSV不同分离物划分为4个类群，LYSV-HLJ与南韩和巴西大蒜上的LYSV有较近的亲缘关系，同属于ⅳ类，表现一定的寄主相关性。

黑龙江省是我国大蒜的重要产区之一，但近年大蒜病毒病的发生日益严重，尤其是LYSV发生比较普遍，且尚无有效的检测方法。本研究通过对LYSV CP基因的序列分析，明确了侵染黑龙江大蒜病毒LYSV病原小种的进化关系，为该病毒的分子鉴定提供了理论依据，也为进一步扩增病毒的基因组全序列、了解LYSV的变异与环境之间的关系、致病性分化等奠定了基础。

[1]Chen J,Chen J P,Adams M J.Characterization of some carlaand potyviruses from bulb crops in China[J].Archives of Virology,2002,147(2)∶419-428.

[2]郑国华,明艳林.分子检测韭葱黄条病毒的研究[J].植物病理学报,2005,35(6)∶105-107.

[3]Van Dijk P.Survey and characterization of potyviruses and their strains of Allium species[J].European Journal of Plant Pathology,1993,99∶1-48.

[4]高山林,金雍安,蔡朝晖,等.大蒜分生组织培养脱病毒和快速繁殖技术[J].植物资源与环境学报,2000,9(3)∶15-18.

[5]周桂珍,曹鸣庆,裘季燕,等.京郊大蒜病毒的研究及其鳞茎中病毒的脱除[J].植物病理学报,1989,19(3)∶145-149.

[6]张明厚,魏培文,朱俊华,等.大蒜茎尖组培苗的检测[J].东北农业大学学报,1999,30(2)∶105-110.

[7]Takaki F,Sano T,Yamashita K,et al.Complete nucleotide sequences of attenuated and severe isolates of Leek yellow stripe virus from garlic in northern Japan∶Identification of three distinct virus types in garlic and leek world-wide[J].Archives of Virology,2005,150∶1135-1149.

[8]张威,张匀华,李学湛,等.应用RT-PCR分子检测技术快速检测大蒜普通潜隐病毒[J].植物保护,2008,34(1)∶133-137.

[9]侯义龙,张开春,吴禄平,等.果树组织中总RNA提取的新方法[J].沈阳农业大学学报,2002,33(2)∶122-125.

[10]萨姆布鲁克J,拉塞尔D W.分子克隆实验指南（上、下册）[M].黄培堂,王嘉玺,朱厚础,等译.3版.北京∶科学出版社,2002∶8.

[11]王劲波,王凤龙,钱玉梅,等.山东省烟草病毒病原鉴定[J].中国烟草科学,1998(1)∶26-29.

[12]Van Regenmortel M H V,Fauquet C M,Bishop D H L,et a1.Virus taxonomy[M].California,USA∶Academic Press,2000.

[13]洪健,李德葆,周雪平.植物病毒分类图谱[M].北京∶科学出版社,2001.

[14]Ward C W,Weiller G,Shukla D D,et al.Molecular systematics of the potyviridae,the largest plant virus family.Molecular basis of virus evoluation[M].London∶Cambridge University Press,1995∶477-500.

[15]Rudra P S,Nie X Z,Singh M.Duplex RT-PCR reagent concentrations at reverse transcription stage affect the PCR perform[J].Journal of Virological Methods,2000,86(2)∶121-129.